前立腺の表面タンパク質プロファイリング

Communications Biology volume 5、記事番号: 1402 (2022) この記事を引用

2343 アクセス

11 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞外小胞 (EV) は細胞間コミュニケーションのメディエーターであり、有望な種類のバイオマーカーです。 EV の表面タンパク質は、レシピエント細胞との結合を確立する上で決定的な役割を果たしており、診断アッセイの推定対象となっています。したがって、表面タンパク質の分析は、EV の生物学的機能を解明し、潜在的なバイオマーカーを特定するのに役立ちます。私たちは、EV で発見された表面タンパク質を最初に同定し、次に検証するために、高分解能質量分析法 (HRMS) と近接ライゲーションアッセイ (PLA) を組み合わせた戦略を開発しました。私たちはワークフローを適用して、精液に含まれる小型EV（SF-sEV）の表面タンパク質を調査しました。我々は 1,014 個の表面タンパク質を同定し、SF-sEV の表面にこれらのサブセットが存在することを確認しました。私たちの研究は、HRMSによる公平なスクリーニングからPLAによる超高感度の標的分析に至るまで、患者および病理学的状態にわたるEVの表面タンパク質の詳細な分析のための一般的な戦略を実証しています。

細胞外小胞 (EV) は、ほとんどの細胞から分泌される脂質二重層ナノ粒子です。 EV には 3 つの主要なサブグループがあり、サイズ、生合成、密度に従って分類されます: (i) エキソソーム、(ii) 微小胞、および (iii) アポトーシス小体。エキソソームは、サイズが 30 ～ 150 nm の範囲の小型 EV (sEV) であり、エンドソームの内向き出芽によって生成され、多胞体 (MVB) の生成につながります。 MVB は最終的に細胞膜と融合し、その sEV 内容物を細胞外マトリックスおよび体液中に放出します。sEV は細胞間コミュニケーションにおいて重要な役割を果たすことが示されています 1、2、3、4、5。サイズ範囲 100 ～ 800 nm の微小胞およびサイズ範囲 200 nm ～ 5 μm のアポトーシス小体は、それぞれ生細胞およびプログラム細胞死を起こしている細胞の原形質膜から直接脱落します6。 sEV、微小胞、アポトーシス小体は、タンパク質、脂質、低分子 RNA、その他の RNA 種、ゲノム DNA 断片を含む分子カーゴの送達のための細胞間輸送を媒介できます 1、7、8。

最近の研究では、EV の内容が細胞系統に応じて異なり、それによってそれらが由来する細胞を反映していることが実証されました。 sEV フィンガープリントの動的変動の分析は、疾患を追跡および監視するための貴重な手段を提供する可能性があります9、10、11、12、13。循環バイオマーカーに焦点を当てた現在の分子研究およびアッセイは、主に循環 sEV の RNA および脂質含有量を評価していますが、sEV のタンパク質組成を調査することへの関心も高まっています 3。特に、EV の表面タンパク質は、標的細胞との接触を確立する役割を果たしており、分子積荷の放出前に細胞への取り込みや細胞膜との融合を引き起こす可能性があるため、非常に興味深いものとなっています 14。

プロスタソームとしても知られる精液 sEV (SF-sEV) は、前立腺から精液中に分泌され、その重要な機能の 1 つは精子細胞と直接相互作用して保護することです 15、16、17。 SF-sEV と精子原形質膜の融合は、受精能力を獲得するために必要な精子の成熟の最後のステップの 1 つである運動性や受精能獲得など、精子細胞機能のさまざまな側面の調節に必要です 18,19。 SF-sEV は、前立腺がん細胞とその微小環境の間の相互作用にも関与していると考えられています 20。 SF-sEV は、男性不妊症 21 および前立腺がん 22,23 における潜在的なバイオマーカーとして認識されていますが、その産生を導く細胞機構や SF-sEV 機能を駆動する分子経路についてはほとんど知られていません。

質量分析 (MS) ベースのタンパク質分析は、EV タンパク質の特性を評価するために効率的で広く使用されているツールです 24,25。 MS によって生成されたデータは、ExoCarta (www.exocarta.org)26 や Vesiclepedia (www.microvesicles.org) などのオンラインデータベースの開発に貢献しています。これらのデータベースには、sEV を含む EV に含まれるタンパク質がリストされています 27。 EV に存在量が少ない膜タンパク質の MS ベースの分析には、いくつかの生化学的手法が適用されています 28。特に、スルホ-NHS-SS-ビオチンなどの化学的誘導体化用の非膜透過性試薬は、膵臓がん細胞 30 および HMC-1 マスト細胞株 31 の細胞表面タンパク質 29 と EV 表面タンパク質の両方を研究するために導入されています。

ただし、MS ベースの戦略だけでは、EV 表面上のタンパク質の正しい局在化と配向を確立できません。したがって、電子顕微鏡や超解像度顕微鏡と組み合わせた免疫親和性法など、直交する方法32、33を適用するさらなる検証実験がしばしば必要となります34、35、36、37。一般に、酵素結合免疫吸着検定法 (ELISA) およびその他の親和性ベースのアッセイは、無傷の EV 上の既知の表面分子を検出するために使用されます。それにもかかわらず、これらの方法は、アッセイごとに 2 つの標的タンパク質のみを調べることができ、非特異的結合や交差反応性によって結果が損なわれる可能性があるため、表面タンパク質の広範で多重的な研究には適していません。抗体アレイは、最近、EV 関連タンパク質の大規模なセットの検出にさまざまな形式で適用されています 38,39,40 が、抗原認識スペクトルが限られているため、生物学的および臨床的に関連する EV タンパク質の公平な発見には適合していません。多重化能力とサンプル要件が低いにもかかわらず。

この研究では、ビオチン誘導体化表面タンパク質の高分解能 MS (HRMS) 分析とフローサイトメトリーベースの近接ライゲーションアッセイ (Exo-PLA) および/または固相近接ライゲーションアッセイ (SP-PLA) (図 1)。フローサイトメトリーは、表面細胞マーカーを測定する強力な技術であり、臨床現場で細胞プロファイリングに日常的に使用されるツールです 41,42。この技術は、ビーズのアレイの分析にも役立ちます 43,44。 EV の部分集団を区別できる可能性があるため、フローサイトメトリーは sEV の調査にとって特に魅力的です。ただし、サイズが小さく、表面分子の数が少ないため、従来のフローサイトメトリーを使用する機会は依然として限られています。多色検出およびシグナル増幅技術である Exo-PLA の使用により、sEV のフローサイトメトリー分析におけるサイズとシグナルの制限を克服することが可能になります。実際、ローリングサークル増幅 (RCA) による局所シグナル増幅を利用すると、フローサイトメトリーのカットオフを十分に上回る個々の sEV が検出可能になります。抗体などのさまざまなアフィニティーバインダーやいくつかの蛍光色素を使用することにより、sEV のさまざまな部分集団を視覚化し、列挙することができます 45,46。 SP-PLA は、リアルタイム PCR による読み取りによる 3 つの抗体の組み合わせによるターゲットの認識に依存しており、溶液中の sEV の検出に優れた感度と特異性を提供します 23。

a SEV はそれぞれヒト精液と PC3 培養培地から単離され、溶解バッファーを添加する前に、sEV 表面の外膜タンパク質をビオチン化するためにスルホ-NHS-SS-ビオチンで処理されました。ビオチン化された表面タンパク質はストレプトアビジンビーズ上に捕捉され、DTT によって放出されました。 b 総タンパク質、総マイナス表面タンパク質、および表面タンパク質を消化し、ラベルフリーの半定量 HRMS 分析によって同定しました。 c これらのタンパク質の存在は、Exo-PLA および SP-PLA によって検証されました。

私たちはこのワークフローを適用して、男性生殖能力の必須の決定因子および潜在的な癌バイオマーカーとしての SF-sEV を調査しました。この研究では、SF-sEVの表面タンパク質に関する現在の知識を拡張し、それによってその生物学的役割を評価し、診断目的で分子レベルでSF-sEVを同定および分類できるようにすることを目指しました。

ヒト精液 (SF-EV) および前立腺がん細胞株 PC3 からの SEV は、各マトリックスに適合する最適化されたプロトコルに従って精製されました 47。この手順には、超遠心分離、サイズ排除クロマトグラフィー、およびショ糖勾配分離の組み合わせが含まれます。精製小胞の品質は、細胞外小胞研究のための最小限の情報 (MISEV) 2018 ガイドラインの推奨に従って、ネガティブ染色透過型電子顕微鏡 (TEM)、ウェスタンブロット、およびナノ粒子追跡分析 (NTA) によって検査されました。陰性染色EMにより、構造的に無傷なSF-sEVおよびPC3 sEVが明らかになりました（図2a）。ウェスタンブロット分析を行って、sEV マーカー CD9、CD63、CD81 および腫瘍感受性遺伝子 101 タンパク質 (TSG-101) の存在、および小胞体 (ER) マーカーカルネキシンの非存在を実証しました。これは、sEV サンプルの純度を示しています。タンパク質の汚染 (図 2b)。 NTA により、SF-sEV (精液由来) と PC3 sEV の平均粒径はそれぞれ 190 nm と 160 nm で、平均濃度はそれぞれ 1.3 × 109 粒子/ml と 1.4 × 109 粒子/ml であることが明らかになりました (図.2c)。

a SF-sEV および PC3 sEV のネガティブ染色 EM。 b sEV マーカー TSG-101、CD63、CD81、および CD9 のウェスタンブロットの結果。 ER マーカーのカルネキシンをネガティブコントロールとしてターゲットにしました。 c モード粒子直径の NTA 分析では、SF-sEV と PC3 sEV でそれぞれ 155.8 nm と 192.2 nm の値が記録されました。 d 精製の品質は、PC3 sEV および SF-sEV Repl 2 および Repl 3 のゲル電気泳動によって評価されました。A: 総マイナス表面画分 PC3 sEV。 B: 合計から表面積分率 SF-sEVs Repl 2 を差し引いた値。 C: 合計マイナス表面 SF-sEV 画分 Repl 3。 D: 表面 SF-sEV 画分 Repl 2。 E: 表面 SF-sEV 画分 Repl 3。 F: 表面画分 PC3 sEV。

無傷の SF-sEV および PC3 sEV の表面タンパク質は、第一級アミンと反応する膜不透過性試薬であるスルホ-NHS-SS-ビオチンを使用して標識されました 30。精製プロセスから得られた画分は次のとおりです。(i) 総 sEV ライセート中のタンパク質 (合計)。（ii）sEV表面から単離されたタンパク質（表面）、および（iii）表面タンパク質の単離後に残った上清タンパク質（総マイナス表面）（図1aおよび2d）。各画分のタンパク質をトリプシンで消化し、HRMS で分析しました (図 1b)。全 PC3 細胞溶解物を調製し、対照として分析しました。 SF-sEV、PC3 sEV、および PC3 細胞溶解物のすべての画分にわたって同定されたタンパク質の完全なリストは、補足データ 1 に報告されています。この研究で特定されたすべてのタンパク質について、補足データ 1 の表は次のように報告しています。 1- 遺伝子オントロジー ( GO) 注釈; 2- ローカリゼーション。 3- 生物学的プロセスへの関与、4- 分子機能。UniProt Knowledgebase データベース (UniProtKB) からダウンロードしたデータを使用して、組織の特異性と経路に関する注釈を提供します。 HRMSによって同定された単離された表面タンパク質は、Exo-PLAおよびSP-PLAを使用してsEV表面上に発現されることが確認されました（図1c）。 sEV精製の品質はゲル電気泳動によって評価されました（図2d）。さらに、ワークフローの堅牢性を評価するために、SF-sEV サンプルを反復して準備および分析しました（「方法」、補足図 1a ～ c および補足図 2b ～ g を参照）。サンプル調製のプロトコールでは、反復間のばらつきが低いことが実証されました (7 ～ 19%)。同じ生物学的サンプル（Rep 2およびRep 3）の技術的複製を比較すると、合計1,364個のタンパク質のうち1,086個が合計マイナス表面（補足図1b）について共通であることがわかり、合計915個のうち653個が表面（補足図1c)。技術的複製と生物学的複製を合計マイナス表面積について比較した場合、Rep 1とRep 2では41個のタンパク質が共通に見つかり、Rep 1とRep 3では64個のタンパク質が共通でした（補足図1b）。表面 Rep 1 対 Rep 2 では、46 個の共通タンパク質が同定されましたが、Rep 1 対 Rep 3 の共有タンパク質の数は 31 でした（補足図 1c）。正規化ペプチドスペクトル一致（nPSM）における相対的なタンパク質存在量間の高い相関が反復間で見つかりました（ピアソンのr：0.84〜0.99;補足図2）。

複製で同定されたタンパク質を結合した後、総溶解物、表面、および総マイナス表面の画分を分析した結果、それぞれ1414、1014、および1460個のタンパク質が同定されました（補足図1、補足データ1、および図3b）。。図 3 に示すように、すべてのサンプルにわたって 875 個のタンパク質が同定され、381 個のタンパク質が全ライセートと全マイナス表面との間で共通し、20 個と 39 個のタンパク質が表面と全マイナス表面および全ライセートでそれぞれ共通していました。

a SF-sEV および PC3 sEV の MS 分析によって同定されたタンパク質を ExoCarta および GO データベースと比較しました。 b 3 つの SF-sEV 画分で同定されたタンパク質のベン図表示。 c 総マイナス表面積が豊富なタンパク質の遺伝子オントロジー細胞成分カテゴリー (GO-CC) の円グラフ表示。 d 表面画分に富むタンパク質の GO-CC カテゴリ。 e 総マイナス表面画分が豊富なタンパク質について、DAVID での機能アノテーション分析によって得られた上位 10 の用語。 f 表面画分に富むタンパク質について DAVID で特定された上位 10 の用語。少なくとも 2 つのサンプルで同定されたタンパク質のみが分析に含まれました。

すべての精液および PC3 sEV 画分にわたって半定量的プロテオミクス分析を実行するために、同定された各タンパク質に関連するペプチドスペクトルマッチ (PSM) の数を、各サンプルで同定された PSM の総数に従って正規化し、nPSM を取得しました。。 SF-sEV の表面画分で同定された 50 個の最も豊富なタンパク質には、セミノジェリン-1 (SEMG1)、セミノジェリン-2 (SEMG2)、フィブロネクチン (FN1)、CD13、CD10、脂肪酸シンターゼ (FASN)、クレアチンキナーゼ B ( CKB）。 SEMG1 と SEMG2 は特に豊富で、nPSM 値はそれぞれ 8.1 と 5 でした (表 1 と補足データ 1)。私たちの分析の結果、現在ExocartaデータベースにもUniProtKBにもsEVタンパク質としてリストされていない273の新しい推定sEVタンパク質が同定されました（図3a）。インタクトな sEV 上でスルホ-NHS-SS-ビオチンを使用したタンパク質標識による表面タンパク質の同定は、表面タンパク質抽出の 100% 効率を保証するものではなく、画分間のある程度の汚染が予想される可能性があります。したがって、各画分で最も高濃度に濃縮されたタンパク質を特定するために、倍数変化ランキングと t 検定統計が使用されました。総表面画分を差し引いたタンパク質（変化倍数（FC）>2および/またはP値<0.05）と比較して、表面画分で独自にまたはより豊富に見出されるタンパク質を、表面富化として定義しました。表面画分に比べて総マイナス表面画分に富むタンパク質をカーゴ富化として定義した。分析の結果、74 個の表面に富む SF-sEV タンパク質が同定され、そのうち 43 個は GO 細胞成分分類に従って膜タンパク質として分類されました (補足データ 1 および 2)。

遺伝子/タンパク質の検出とタンパク質間相互作用の予測のための検索ツールおよび生物学的データベースである STRING を使用して、74 の表面濃縮タンパク質の機能とネットワークを分析しました (https://string-db.org/)。タンパク質は 7 つの基準に基づいて分析されました: (1) サイトゾルでの発現、(2) 疾患発症への推定関与、(3) 免疫系での役割、(4) 男性生殖系における推定機能、(5) タンパク質の存在EV では、(6) 精嚢、(7) 多嚢体。これらのタンパク質の簡単な機能説明は補足データ 3 にリストされており、各タンパク質の 1 つ以上の基準を満たすことは補足図 3 に示されています。

合計のマイナス表面と比較して、表面画分で最も濃縮されたタンパク質は、KRT2、DNAJC3、およびCASP14でした（図4a、b、補足データ2、3つの反復）。 SF-sEVの表面画分に豊富に存在するタンパク質の中で既知のsEVマーカーは、ANPEP、FASN、およびCLUでした（図4c）。

a 表面および合計マイナス表面画分で同定されたタンパク質を、倍率変化および t 検定統計分析によって比較しました。 a 棒プロットは、表面画分および表面画分を除いた合計における最も濃縮された 25 個のタンパク質の比率を表します。 b ボルケーノプロットは、少なくとも 2 つのサンプルで同定されたタンパク質の変化倍率と P 値を表します。 c SF-sEVの表面画分における既知のsEVマーカーの正規化ペプチドスペクトル一致（nPSM）の豊富さ。

さらに、表面またはカーゴが豊富であることが判明したタンパク質の細胞内局在、分子機能、および生物学的プロセスのGO用語を分析しました（補足データ1）。 SF-sEV と PC3 sEV の両方について、細胞内局在解析により、表面画分に豊富に存在するタンパク質のうち、細胞外にあると注釈が付けられたタンパク質が高度に濃縮されていることが示されました。細胞外領域に関連するタンパク質はカーゴ画分の3％でしたが、表面画分のタンパク質の最大13％は表面タンパク質として注釈が付けられました（図3c、d、および補足図4および5）。同様に、分子機能と生物学的プロセスのGO用語の分析により、表面タンパク質とカーゴタンパク質の明確な特異的特性が明らかになり（補足図4）、DAVIDデータベースを使用して実行された機能注釈分析によって要約されます（図3e、f））。機能的GO分析により、表面画分で高度に富化された用語はカルシウム結合と中間フィラメントであり、カーゴに富むタンパク質では細胞質とアセチル化が上位の用語であることが明らかになった。 GOカテゴリごとにDAVIDによって取得された上位10の生物学的用語が補足図4にリストされています。

無傷の SF-sEV および PC3 sEV の表面上の MS によって同定されたタンパク質の存在は、特異的な Exo-PLA または SP-PLA テストを開発することによってさらに調査されました。 Exo-PLA は、複数の抗体プローブペアを使用して sEV を視覚化します。一対のプローブの両方のメンバーが sEV の表面で互いに密接に結合すると、環状 DNA 鎖が物理的に生成され、RCA 産物が生じます。 RCA 産物の反復配列は、ハイブリダイゼーションプローブを使用して視覚化され、蛍光色素で標識され、フローサイトメトリーで検出されます。この強力なツールにより、表面に発現するタンパク質の組み合わせのみに基づいて sEV 亜集団の分子識別が可能になります 45。ゲート戦略は補足図6aで説明されています。既知の高発現 sEV マーカーをコントロールとしてターゲットとする Exo-PLA プローブの組み合わせを使用し、HRMS 分析を通じて特定されたターゲットを選択して、SEMG1、前立腺酸性ホスファターゼ (ACPP)、前立腺特異抗原 (PSA)、前立腺表面に特異的膜抗原 (PSMA)、プロスタグランジン D2 (PTGDS)、CD59、A-キナーゼアンカータンパク質 (AKAP4)、システインリッチ分泌タンパク質 1 (CRISP1)、精巣特異的グリセルアルデヒド-3-リン酸デヒドロゲナーゼ (GAPDS) SF-sEVとPC3 sEVの比較（図5a）。特に、CD59 または PSMA のいずれかで SEMG1 を発現する SF-sEV の 2 つの異なる亜集団を同定しましたが、PC3 sEV では、SEMG1 と CD59 の発現はそれほど豊富ではありませんでした。 SEMG1、PSMA、および PTGDS を対象とした Exo-PLA プローブの組み合わせにより、SF-sEV と PC3 sEV の両方について二重および三重陽性の集団が明らかになりました。 SEMG1、GAPDS、およびAKAP4に対する抗体複合体の組み合わせにより、SF-sEVでは二重陽性および三重陽性集団が同定されましたが、PC3 sEVでは同定されませんでした（図5a）。これは、AKAP4の存在量が最も多かったMSデータを裏付けています。 SF-sEVの表面タンパク質を含む画分をPC3 sEVのそれと比較した。 SEMG1 と ACPP、および SEMG1 と CRISP1 の二重陽性集団も、SF-sEV と PC3 sEV の両方で見つかりました。ただし、SF-sEV のトリプル陽性集団は、SEMG1 と PSMA および PTGDS または SEMG1 と AKAP4 および GAPDS 陽性の集団と比較すると、はるかに少ないようです。さまざまな蛍光シグナルの追加の対照として、蛍光RCA産物の視覚化と最終検証のためにサンプルを蛍光顕微鏡で検査しました（補足図6b）。

a Exo-PLA によって検出された sEV の表面上のさまざまなマーカーの組み合わせ。フローサイトメトリーにおける陽性シグナルのゲーティングとさまざまな集団が表示されます。 b SF-sEVは、HRMS分析によって特定された特定の標的（CRISP1、AKAP4、GAPDS、SMG1、およびPTGDS）に対する抗体でコーティングされたビーズによって捕捉され、各パネルに示され、CD9およびCD26マーカーに対するPLAプローブで検出されました。豊富なマーカー CD68 をアッセイ性能のポジティブコントロールのキャプチャとして使用し、ER マーカーのカルネキシンをネガティブコントロールのキャプチャ抗体として使用しました。 x 軸は、サンプルの濃度を 1 ml あたりの総タンパク質の ng 単位で表示します。 y 軸は、サンプルの SP-PLA 反応のリアルタイム PCR 読み取りの閾値サイクルとネガティブコントロール (サンプルを含まないアッセイバッファー) の閾値サイクルの間の差を表示します。エラーバーは標準偏差 (SD) を表し、各サンプルは 3 回実行されました。

免疫親和性ベースの SP-PLA は、最大 3 つの表面タンパク質を標的とすることで、無傷の sEV を検出および定量する機会を提供します。この実験設定では、まず、標的タンパク質 CRISP1、SEMG1、PTGDS、AKAP4、または GAPS のいずれかに対する抗体を使用して SF-sEV を捕捉しました。次に、既知のマーカー CD9 および CD26 に対する一対のオリゴヌクレオチド結合抗体プローブを使用して、捕捉された SF-sEV を検出しました。 AKAP4 および GAPDS に対する抗体によって捕捉された SF-sEV と比較して、CRISP1、SEMG1、または PTGDS 抗体に対する抗体によって SF-sEV が捕捉された場合には、より高い検出シグナルが記録されました。それにもかかわらず、すべてのターゲットはSF-sEVの表面で確実に検出できました（図5b）。予想どおり、ER マーカーのカルネキシンを標的とする捕捉抗体を使用したネガティブコントロール実験では、高サンプル濃度でも検出できないシグナルが得られました (図 5b)。 SP-PLA データは Exo-PLA によって得られたデータと一致しており、HRMS 分析で同定されたタンパク質の表面発現をさらに裏付けています。

sEV の膜上に発現するタンパク質の正体に関する情報は、診断および調製手順に役立ちます。この研究では、HRMSとExo-PLA45およびSP-PLA49を使用した不偏プロファイリングを組み合わせて、無傷のsEVの表面に同定されたタンパク質の存在を検証することにより、sEVの表面タンパク質を調査するための最先端の戦略を開発しました。。偏りのない MS アプローチの使用により、SF-sEV および PC3 sEV で合計 1,730 個のタンパク質を同定することができ、そのうち 273 個はこれまで報告されていなかったため、循環している SF-sEV およびその他の sEV の将来の研究に潜在的な標的のリストが提供されました。 (図3a)。

本明細書に記載の戦略は、細胞表面タンパク質およびEV表面タンパク質を研究するための効率的な手段を提供する29。このアプローチは、SF-sEV上の合計1014個の推定表面タンパク質を同定するのに役立ち、3つの複製サンプルすべてで457個のタンパク質が見つかり、少なくとも2つの複製サンプルで730個が見つかりました（補足図1）。 1,014 個のタンパク質のうち、私たちのデータは、合計マイナス表面タンパク質画分と比較した場合に、sEV の表面でのみ濃縮されていることが判明した 74 個のユニークなタンパク質を特定しました (補足データ 1 および 2)。各画分に対して調製された複数の複製サンプルで同定されたタンパク質は、最も確実な発見を表し、合理的にはその画分で最も豊富なタンパク質でもあります。ただし、3 つの複製サンプルで見つかった 3 つのタンパク質 (SEMGI、PTGDS、および CRISP1)、2 つの複製サンプルで見つかった 1 つ (AKAP4)、および 1 つの複製サンプルで見つかった 1 つのタンパク質 (GAPDS) については、PLA ベースの検証ステップを引き続き含めました。）。

特定の組織または細胞型によって放出される SEV は、不均一な EV 集団を表します50。実際、精液 SF-EV は男性生殖系のいくつかの異なる細胞型に由来すると報告されており 51,52、おそらく不均一なタンパク質発現および不均一な機能に寄与していると考えられます。データの包括的なプロテオミクス分析により、74 の表面タンパク質が SF-sEV の細胞外タンパク質に富んでいることが明らかになりました (補足データ 2 および図 3)。これは、Webber らによる以前の観察と一致していました 53。著者らは、タンパク質測定に SOMAscan アレイを使用して、前立腺から分泌されると考えられているタンパク質が実際には EV の表面に存在する可能性があることを実証しました。したがって、sEVの表面タンパク質の評価に焦点を当てた我々のデータは、生体液中で測定されたタンパク質の一部がsEVの表面にも露出している、または単独で露出している可能性があるという仮説を補強するものである。

精子細胞における遺伝子発現とタンパク質合成は精子形成が終了する前に中断されるため、精子細胞はその完全な機能に必要な分子の一部をSF-EVから獲得することが報告されており、SF-EVは、精子との融合によって必須タンパク質を輸送することが示されている。細胞膜54．精子の受精能獲得は、Ca2+ シグナル伝達が重要なプロセスです。 Parkらによって仮説が立てられているように、精子細胞はCa2+シグナル伝達のイオンチャネルを含まない他の機構も使用している可能性がある55。このような機構は、Ca2+動員に必要な受容体と酵素を運ぶSF-EVと精子細胞膜の融合に依存している可能性がある。 SF-EV から精子への CD38 の移動がリアノジン受容体からの細胞内 Ca2+ 放出を引き起こす可能性があることが以前に示されています (53)。 Parkの仮説と一致して、私たちのデータは、カルシウムイオンの結合を促進するタンパク質がSF-sEVの表面画分で最も高度に濃縮されたタンパク質の1つであることを示唆しています（図3fおよび補足図4）。 SF-sEVの表面で特に豊富に見つかった74個のタンパク質のうち5個、CRTAC1、AGRN、GAS6、NUCB2、NUCB1、およびFLG2は、カルシウム結合タンパク質としてGOに注釈が付けられています（補足データ1）。

SF-sEV 内の多数のタンパク質の同定。これらは中枢神経系でも発現することが知られています (補足データ 1) (キネシン重鎖アイソフォーム 5C (KIF5C)、シナプス小胞膜タンパク質 VAT-1 など) 、14-3-3 タンパク質シータ (YWHAQ)、乳癌増幅配列 1、伸長因子 1-α 1 (EEF1A1)、脳酸可溶性タンパク質 1 (BASP1))、または脳内で高度に発現するタンパク質の存在神経内分泌前立腺上皮 (前立腺幹細胞抗原 (PSCA)) は、これまでに示唆されている SF-EV の神経内分泌起源と、神経伝達物質としての既知の潜在的な効果を裏付けています 56,57。ただし、CatSper 受容体 55、クロモグラニン B、神経ペプチド Y56 などのタンパク質はこの研究では同定されませんでした。

HRMS によって同定された表面タンパク質のサブセットは、外部に露出した表面タンパク質を介して無傷の sEV を検出できる抗体ベースの方法を使用して検証するために選択されました。 PLA は、DNA オリゴヌクレオチドに結合した抗体からなる 2 つ以上のプローブを使用して、タンパク質の組み合わせを近接して共局在化することにより検出する機能を提供する、ユニークで強力な分子アッセイです。このようなプローブの近接結合により、PCR または RCA による増幅および視覚的な検出/確認のためのシグナル増幅のための DNA テンプレートが生成されます。 PLA 形式の 1 つである 4PLA は、前立腺がん患者の血漿中の SF-sEV レベルの上昇を実証するために適用されることに成功しました 23。したがって、Exo-PLA と SP-PLA 法の組み合わせは、補完的な情報と、診断アッセイの標的となる可能性のある表面タンパク質を同定するためのユニークな機会を提供します。 SP-PLA ではタンパク質表面組成の同定/検証により sEV 亜集団から精製された sEV の同定が可能ですが、Exo-PLA アッセイは生体液からの sEV の定量化に感度をもたらします。

Exo-PLA を使用して、SF-sEV および PC3 sEV の表面に SEMG1、ACPP、PSA、PSMA、PTGDS、AKAP4、CRISP1、および GAPDS が存在することを確認しました。 PSA、ACPP、および PSMA は、前立腺生理学における役割および前立腺がんバイオマーカーとしてよく知られています。 SF-EV の表面上の PSA の存在は以前に報告されています 58 が、この研究で同定された ACPP と PSMA は内在性膜タンパク質 59 であり、PSMA はリソソームの膜でのみ同定されています 60。 SEMG1、AKAP4、CRISP1、GAPDS、および PTGDS についてはあまり知られていませんが、我々の知る限り、これらは SF-sEV またはその他の sEV の表面に局在していることはこれまでに報告されていません。

SEMG1 および 2 は、ヒト精液凝塊および精漿（タンパク質含有量の 20 ～ 40%）の主要成分であることが知られています 61,62。タンパク質発現分析により、SEMG1 は主に精嚢の腺上皮で発現していることが明らかになり、いくつかの研究では前立腺がん細胞での発現が実証されています 63,64。 Yangらは、これらのタンパク質がSF-EVの不可欠な構成要素であることをすでに実証している25。 SEMG 1 は、グリコシルホスファチジルイノシトール (GPI) アンカー型および可溶型 CD52 の両方と複合体を形成していることが発見されており、GPI アンカー型 CD52 は精細胞をアンカーして血栓を形成する際に SEMG1 のドックとして機能し 65、その後 PSA によって分解されて血栓が形成されるのではないかという仮説が立てられています。精子の運動を可能にします。最近の研究では、精子の運動性と精子に結合した SEMG の割合との間に負の相関関係があることが判明しました 66,67。これらの発見は、結合していない精子が生体内受精に関連するパラメーターである可能性があることを示唆しています68。

GAPDS、AKAP4、および PTGDS が SF-EV の表面で発現していることはこれまで知られていなかったが、これらはすべて精子細胞表面関連タンパク質 69,70 として同定されており、両方とも精子の運動性 71,72 および哺乳動物の卵細胞受精に関与している 73 。したがって、我々の研究で同定されたSEMG1および他のタンパク質は、実際に前立腺細胞および精巣上体細胞から精子細胞の表面に移行し、それらの生理学的機能を可能にし、および/または強化することに貢献している可能性があると考えられます。

ビオチン標識後に表面タンパク質を単離するアプローチには、いくつかの制限がある可能性があります。第一に、一級アミンの利用可能性に依存するプロセスであるビオチン標識の効率は、タンパク質によって異なる可能性があります。第二に、ストレプトアビジンでコーティングされたビーズを使用した精製は部分的または不完全である可能性がありますが、均一な表現であり、ビーズへの非特異的結合のリスクがあります74、75、76。これは、たとえば、PSMA1、CD9、CD151 などの一般的な sEV/SF-sEV マーカーがすべての分析画分 (表面、合計マイナス表面、および合計ライセート) で検出されたものの、濃縮された理由である可能性があります。表面画分（図4および補足データ1）。第三に、同定された表面タンパク質には、体液や培養培地中に存在するプロテインコロナとして知られる吸収層タンパク質が含まれている可能性があり、これらはEVの表面に結合し、そこで特定の機能を果たしたり、研究時にタンパク質汚染源となる可能性がある。膜タンパク質77,78。

このアッセイを開発することにより、我々は表面タンパク質、特に SF-sEV のタンパク質の測定の実現可能性を実証し、新しい診断アッセイの開発と前立腺がんの検出のための潜在的な標的を提供する可能性があります 23。私たちの分析は、精子細胞が完全に機能するために必要なメカニズムを調査する分子スクリーニングを提供することにより、男性の生殖能力を評価するための診断ツールの開発の基礎を提供する可能性があります79。ここで説明する SF-sEV 表面タンパク質の調査は、SF-sEV タンパク質を同定するためのターゲット PLA と不偏 MS プロテオミクス解析の力を組み合わせたワークフローの概念実証を示していますが、あらゆる種類の EV に応用できる可能性があります。 SP-PLA は、高感度および特異性で EV を定量化する独自の可能性を提供します。一方、Exo-PLA は、個々の EV およびマルチパラメータ分析を特徴としており、推定上のEV の役割の詳細な調査をサポートする最適なプラットフォームになる可能性があります。患者および病理学的状態全体の表面タンパク質。これらのアッセイは両方とも、臨床応用に直接応用できる可能性があります。

精漿は、既存の手順に従い、内部審査委員会の承認の下、ウプサラ大学病院の生殖センターで収集されました8。この研究で分析された SF-sEV の 2 つの匿名化サンプル (サンプル 1 および 2) は、それぞれ 5 人の個人からの精漿サンプルをプールすることによって得られました。サンプル収集はウプサラ大学の倫理委員会 (Ups 01-367) によって承認され、インフォームドコンセントが得られました。 SF-sEV は、精液から sEV を分離するための最適化されたプロトコルを使用して精製されました 80。ヒト精漿を 3000 × g で 10 分間遠心分離し、その後 4 °C で 30 分間 10,000 × g で遠心分離し、破片をペレット化しました。続いて、上清を 100,000 × g、4 °C で 2 時間超遠心分離しました。 EVを含むペレットをリン酸緩衝食塩水(PBS)に再懸濁し、Superdex 200ゲルを充填したXK16/70カラム(GE Healthcare)でのサイズ排除クロマトグラフィーによってさらに精製した。続いて密度勾配分離を行い、SF-sEV を 1.13 ～ 1.19 g/ml の密度範囲で回収しました。 Pierce BCA タンパク質アッセイ (ThermoFischer Scientific) を使用して、精製した SF-sEV の濃度を 2 mg/ml に調整し、使用するまで -80 °C で保存しました。

ヒト前立腺がん細胞株 PC3 (ATCC-CRL1435) を、2 mM L-Glu、100 U/ml ペニシリン、100 μg/ml ストレプトマイシン、および 10% ウシ胎児血清 (FBS; Gibco, ThermoFisher Scientific、米国）。細胞を70〜80％コンフルエンスまで培養し、その後培地を10％EV除去FBS（System Bioscience、パロアルト、カリフォルニア州、米国）を含む培地と交換し、細胞をさらに48時間増殖させた。細胞を除去し、300×gで10分間遠心分離して馴化培地を収集しました。馴化培地を 0.22 µm フィルター (Merck Millipore、米国マサチューセッツ州バーリントン) に通して細胞破片を除去し、続いて SW-28 型ローターで 112,000 × g で 120 分間超遠心分離 (Beckman Coulter) して sEV をペレット化しました。。上清を注意深く除去し、ペレットを、1×プロテアーゼ阻害剤(Complete Mini(登録商標)、Roche、バーゼル、スイス)を補充した1 mlの氷冷1×PBSに再懸濁した。次に、sEV をクロマトグラフィーカラムにロードし、SF-sEV について説明したのと同じ手順を使用して分離しました 45。 sEV を含む画分をプールし、SW-28 タイプのローターを使用して 112,000 × g で 120 分間超遠心分離を 2 回行いました。得られた sEV ペレットをプロテアーゼ阻害剤を添加した 200 μl の PBS に再懸濁し、使用するまで -80 °C で保存しました。

精製した sEV を解凍し、2% パラホルムアルデヒド (PFA) に再懸濁しました。サンプル 5 μl を Formvar/カーボンコートグリッド上に 20 分間置きました。グリッドを1×PBSで3×1分間洗浄し、次に1%グルタルアルデヒドで5分間インキュベートし、続いて蒸留水で8×1分間の洗浄ステップを行った。サンプルをシュウ酸ウラニル溶液 (pH 7.0) の滴下で 5 分間染色し、次に 4% 酢酸ウラニル (pH 4.0) および 2% メチルセルロースとともに、光から保護して氷上で 10 分間インキュベートしました。過剰の酢酸ウラニルおよびメチルセルロースを濾紙上に吸い取ることによって除去した。グリッドを空気中で 5 ～ 10 分間乾燥させ、80 kV で動作する TEM、FEI Tecnai™ G2 (ThermoFisher Scientific、米国) によって検査しました。

ナノ粒子追跡分析は、小胞サイズ分布を決定するための高速ビデオキャプチャおよび粒子追跡を備えた Nanosight LM10HSB システムを使用して実施されました。各サンプルを 500 倍に希釈し、毎回 30 秒間 5 回の実行で分析し、カメラレベル 10、検出閾値 8、分析ソフトウェア NTA バージョンの自動最小予想粒子サイズと自動ジャンプ距離を使用して、シリンジ速度 50 で記録しました。 3.0パッケージ。

濃度 2 mg/ml の 500 μl の SF-sEV および PC3 sEV を PBS で 2 回洗浄し、112,000 × g で 120 分間超遠心分離しました。ペレットをプロテアーゼ阻害剤を添加した1×PBSに再懸濁し、112,000×gでさらに120分間超遠心分離しました。次いで、ペレットを再懸濁し、プロテアーゼ阻害剤および1 mM EZ-Link スルホ-NHS-SS-ビオチン（Pierce、米国イリノイ州ロックフォード）を添加した500 μl 1× PBS（pH 8.0）中で氷上で30分間インキュベートした。未反応のビオチンは、トリス塩酸を最終濃度 50 mM で添加することによってクエンチされ、15 分間インキュベートされました。遊離ビオチンを除去するために、ビオチン化 SF-sEV および PC3 sEV を PBS で希釈し、112,000 × g で 120 分間超遠心分離しました。次いで、ペレットを溶解緩衝液（６Ｍ尿素、プロテアーゼ阻害剤、ＰＢＳ中１％ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコピラノシド（β－ＯＧ））中に再懸濁し、氷上で１時間インキュベートした。タンパク質の可溶化を改善するために、インキュベーション時間中、サンプルを 5 分ごとに 5 秒間ボルテックスし、その後 30 分間超音波処理しました。溶解物を 10,000 × g、4 °C で 10 分間遠心分離して破片を除去しました。ライセートの一部を保存し（全ライセート）、残りをプロテアーゼ阻害剤を添加した1×PBSで10倍に希釈し、3つのチューブに分け（各チューブには300μgの全溶解sEVが含まれます）、5 mgのストレプトアビジンとともにインキュベートしました。磁気ビーズ (濃度 10 mg/ml; Dynabeads MyOne™、Invitrogen) を室温 (RT) で 60 分間転倒混和しました。次に、ビオチン化表面タンパク質を含むストレプトアビジンビーズを磁石を使用して収集し、プロテアーゼ阻害剤を含む1×PBSで3回洗浄し、一方、非ビオチン化タンパク質（合計マイナス表面）を含む上清を-20℃で保存した。エンドオーバーエンド混合しながら、ＰＢＳ中の５０ｍＭＤＴＴ中で室温で６０分間インキュベートすることにより、タンパク質をビーズから溶出した。次に、溶出したタンパク質（表面）を磁石を使用してビーズから分離し、-20 °C で保存しました。すべてのサンプルの総タンパク質濃度は、製造業者の指示に従って、Dot-it-Spot-it (Maplestone、Knivsta、スウェーデン) によって測定されました。 HRMS に進む前に、サンプルの品質をゲル電気泳動によってチェックしました。サンプルを 4 × LDS サンプルバッファー (Invitrogen) で希釈し、4 ～ 12% Bis-Tris ゲル (Invitrogen、カールスバッド、カリフォルニア州、米国) にロードし、200 V で 50 分間実行しました。製造業者の指示に従って、ゲルを銀染色（GE Healthcare、ピスカタウェイ、ニュージャージー州、米国）によって染色した。

SF-sEV、PC3 sEV、および PC3 細胞を、プロテアーゼ阻害剤を添加した RIPA バッファー (Santa Cruz Biotechnology、カリフォルニア州サンタクルーズ) で溶解し、還元条件下で SDS-PAGE で分離し、iBlot2 ドライブロッティングシステム (ThermoFisher Scientific) でブロットしました。。 LI-COR TBS ブロッキングバッファー (LI-COR Biosciences、リンカーン、ネブラスカ州、米国) をブロッキングと抗体のインキュベーションに使用しました。タンパク質は、1.3 μg/ml 抗 TSG101 抗体、0.5 μg/ml 抗 CD9 抗体、0.5 μg/ml 抗 CD81 抗体、0.5 μg/ml 抗 CD63 抗体、および 0.1 μg/ml 抗カルネキシン抗体を使用して分析されました。これらは、二次抗体として 50 ng/ml ロバ抗マウス IgG IRDye 680LT または 75 ng/ml ロバ抗ウサギ IgG IRDye 800CW を使用して検出され、LI-COR の Odyssey スキャナーを使用して分析されました。抗体に関するすべての情報は補足表 1 にリストされています。

溶液中のタンパク質は還元、アルキル化され、フィルター上でトリプシンによって消化されました。乾燥ペプチドを 0.1% ギ酸に溶解し、注射前に希釈して各サンプルに等量のペプチドをロードしました。ペプチドを nanoLC C18 カラムで逆相で分離し、90 分間の勾配を適用し、HRMS QE-Orbitrap 質量分析計 (Thermo Finnigan) にオンラインでエレクトロスプレーしました。タンデム質量分析は、高エネルギー衝突解離 (HCD) を適用して実行されました。データ検索は、FASTA Uniprot データベース (Homo sapiens、レビュー、2019 年 5 月リリース、20421 エントリ) に対して Proteome Discoverer 1.4 (ThermoFisher Scientific) に組み込まれた Sequest アルゴリズムを使用して実行されました。検索パラメータは「分類: ホモ・サピエンス」に設定されました。酵素：トリプシン。固定修飾はカルバミドメチル (C) で、可変修飾は酸化 (M) および脱アミド化 (NQ) でした。タンパク質同定の検索基準は、少なくとも 2 つの一致するペプチドとタンパク質あたり 95% の信頼水準に設定されました。

Exo-PLA は、Löf et al.45 によって公開されたプロトコルを適応させることによって実行されました。簡単に説明すると、捕捉抗体であるマウスモノクローナル抗CD9、CD63およびジペプチジルペプチダーゼ-4（CD26）の混合物（補足表1）を、前述のように磁気ビーズ上に固定化されたオリゴヌクレオチドに結合DNAオリゴヌクレオチドを介して固定化しました。オリゴヌクレオチドのリストを補足表246に示す。sEV捕捉の効率を最大化するために、3つの抗体の混合物を使用した。捕捉された sEV の表面タンパク質組成を分析するために、多数の PLA プローブ (オリゴヌクレオチド結合抗体) が使用されました。 Exo-PLA は、近接した PLA プローブのペアが RCA 生成物の形成を鋳型とする DNA サークルを生成するとシグナルを発生します。これは、蛍光標識オリゴヌクレオチドで視覚化できます。ここで、1 つの PLA プローブは、同じ DNA オリゴヌクレオチドを 2 つの抗体に結合させることにより、2 つのよく知られたエクソソーム表面マーカー、ネプリライシン (CD10) とアミノペプチダーゼ N (CD13) に対する抗体の混合物を表しました。 2 番目の PLA プローブは、対応する DNA オリゴヌクレオチドを次の sEV 特異的標的に対する抗体に個別に結合させて調製し、sEV の部分集団を同定しました: ACPP、PSA、PSMA、PTGDS、AKAP4、SEMG1、GAPDS、CRISP1、および CD59 (補足データ 1) 。さまざまな RCA 製品で標識された sEV を、BD FACS Aria III または BD LSR Fortessa 機器 (BD biosciences) でのフローサイトメトリーによって分析しました。ターゲット（SF-sEVまたはPC3 sEV）を除くすべての実験試薬を含むネガティブコントロールを使用して、さまざまな集団におけるポジティブシグナルのゲートを設定しました。ゲート戦略は補足図6aで説明されています。各反応について、1 μl の RCA 産物標識 sEV を蛍光顕微鏡による対照用にサンプリングしました。画像は、Zeiss Axio Imager Z2 顕微鏡およびデジタルカメラ Hamamatsu C11440 の 40 倍 Plan-Apochromat 対物レンズ、NA 1.3 を使用して取得されました。

SP-PLA は、いくつかの変更を加えて前述したように実行されました 49,81。簡単に説明すると、メーカーの説明書 (カタログ番号 14301、ThermoFisher Scientific) に従って、次のタンパク質に対して生成した 25 ～ 35 μg の抗体を 5 mg の Dynabeads M-270 エポキシ磁気ビーズに結合しました: Calnexin、TSG101、PTGDS、AKAP4、 CD63、SEMG1、および CRISP1 (補足表 1)。標的 sEV の検出用の 2 つの SP-PLA プローブは、ストレプトアビジン結合オリゴヌクレオチド SLC1 および SLC2 (補足表 2) を、それぞれ CD26 および CD9 に対するビオチン化抗体に 1:1 の比率で結合することによって構築されました。 SF-sEV および PC3 sEV をアッセイバッファー (1 mM D-ビオチン、0.1% BSA、0.05% Tween-20、100 nM ヤギ IgG、100 μg/ml サケ精子 DNA、1x PBS 中の 5 mM EDTA) で希釈しました。 10 倍段階希釈、SF-sEV の場合は 100 μg/ml ～ 100 pg/ml、PC3 sEV の場合は 70 μg/ml ～ 70 pg/ml。 SF-sEV の CD63 を標的とする場合は、20 μg/ml ～ 20 pg/ml の 10 倍希釈系列を適用しました。すべてのサンプルを 3 回繰り返して分析し、200 ng/μl の抗体結合ビーズに捕捉し、反応容量 50 μl のアッセイバッファー中の 500 pM の各 SP-PLA プローブで標識しました。リアルタイム PCR は、25 μl の増幅バッファー (1× PCR バッファー、2.5 mM MgCl2、0.25× Sybr Green、0.1 μM BioFwd プライマー、0.1 μM BioRev プライマー、0.1 μM BioSplint、0.08 mM ATP、0.2 mM dNTP) 中で実行されました。 95 °C で 10 分間プログラムされた QuantStudio 6 リアルタイム PCR システム (Applied Biosystems) で、dUTP)、0.03 U/μl Platinum Taq DNA ポリメラーゼ、0.01 U/μl T4 リガーゼおよび 0.002 U/μl ウラシル DNA グリコシラーゼを使用、続いて95℃で15秒間および60℃で1分間を45サイクル。

この研究では、合計 2 つの SF-sEV の匿名化サンプルが分析されました。各サンプルは、5 人の個人からの精漿サンプルをプールすることによって調製されました。ペプチドスペクトルマッチ (PSM) 値を定性分析および半定量分析に使用しました。ただし、値は総 nPSM に正規化することで変換されました。欠損値は、ランダムではない欠損 (MNAR)82 として扱われ、値 0.05 で置き換えられました (単一値補完アプローチ)。表面タンパク質の濃縮度は、表面画分と表面画分を除いた合計との間の nPSM の比率として計算されました。平均値は、反復が利用可能な場合に計算されました。 SF-sEVの全ライセートの複製1および2（補足図1aおよび2a）は、生物学的複製と技術的複製（サンプル1からのRep1およびサンプル2からのRep2）の両方を表しましたが、表面および合計マイナス表面の3つの複製は1 つの生物学的複製と 2 つの技術的複製が含まれます: Rep 1、サンプル 1 から精製された SF-sEV: Rep 2 および Rep 3: サンプル 2 から精製された SF-sEV。計算された比率の有意性は、t 検定によって評価されました。反復間のばらつきは、[(各サンプルで一意に同定されたタンパク質の数/タンパク質の総数) × 100] として計算されました。データ分析と表現は、統計計算と視覚化のための R 環境とソフトウェア GraphPad Prism (Graph Pad Software Inc.) を使用して実行されました。同定されたタンパク質は Exocarta データベースと比較されました。補足データ 1 にリストされているタンパク質アノテーションのファイルは、Uniprot (http://www.uniprot.org/uploadlists/) からダウンロードされました。アノテーション、視覚化、および統合された発見のためのデータベース Bioinformatics Resources 6.8、NIAID/NIH、および PANTHER 分類システム 83 は、さまざまな画分に富むタンパク質の Gene Ontology (GO) アノテーション (比率 ≥2、複製数 ≥2) に使用されました。）。 Exo-PLA データは、BD FACS Diva ソフトウェア 8.0 (BD biosciences) で分析されました。 SP-PLA の場合、すべてのサンプルを 3 回繰り返して分析し、データを Microsoft Excel ソフトウェアで分析しました。図 1a は、Inkscape ソフトウェアを使用して手動で生成されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

質量分析プロテオミクスデータは、データセット識別子 PXD037791 とともに PRIDE84 パートナーリポジトリを介して ProteomeXchange コンソーシアムに寄託されています。図の基礎となるソースデータは次のとおりです。図３、４および補足図。図1、2、4、5は補足データ1に提供されています。補足図3の基礎となるソースデータは補足データ2に提供されています。トリミングされていない未編集のウェスタンブロット写真は補足図7として利用できます。

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ウプサラ大学の質量分析ベースのプロテオミクスおよびバイオヴィス施設の支援と、NTA での支援をいただいたアーメド・イブラヒム博士に感謝します。この研究は、SciLifeLab、助成金 2020-02258、2017-04152、2018-02943、2018-06156、2018-02806、および 2015-4870 に基づくスウェーデン研究評議会、助成金 M130/16 に基づく Torsten Söderbergs Stiftelse、スウェーデン前立腺の支援を受けました。がん連盟、Exodiab、スウェーデンがん財団、ラジウムヘメットがん研究財団、助成金 SB16-0046 に基づくスウェーデン戦略研究財団。資金提供者はこの研究のいかなる部分にも関与していませんでした。

ウプサラ大学が提供するオープンアクセス資金。

次の著者も同様に貢献しました: Ehsan Manouchehri Doulabi、Claudia Fredolini。

スウェーデン、ウプサラのウプサラ大学、免疫学、遺伝病理学、サイエンス・フォー・ライフ研究所

イーサン・マヌーチェリ・ドゥラビ、クラウディア・フレドリーニ、ラジオサ・ガッリーニ、リザ・ロフ、シェン・チウジン、池渕凌世、アリレザ・アジミ、ウルフ・ランデグレン、マスード・カマリ・モガダム

日本学術振興会日本学術振興会海外特別研究員（東京）

Ryoyo Ikebuchi

スウェーデン、ウプサラのウプサラ大学、医科学部臨床化学部

ルイーズ・デュボワ & アンデルス・ラーション

発見とイノベーションセンター、ハッケンサック・メリディアン・ヘルス、ニュージャージー州ナットリー、米国

オリヴィエ・ルディグ

スウェーデン、ソルナ、カロリンスカ研究所医学部、免疫学およびアレルギー部門

スザンヌ・ガブリエルソン

スウェーデン、ウプサラのウプサラ大学、分析化学部化学科-BMC

ジョナス・バーグクイスト

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MKM、EMD、UL、CF、JB がこのアイデアを考案し、研究を計画しました。 EMD、AA、QS、AL、OL、LD が EV の生産と精製に参加しました。 EMDとCFはタンパク質濃縮実験を実施した。 RG はウェスタンブロットと SP-PLA の実験とデータ分析を計画し、実行しました。 JB は MS 分析を担当しました。 CFはMSデータのデータ解析を企画・実行しました。 EMD と SG は NTA を支援しました。 EMD、RI、および LL は、AACF、EMD、RG、および LL の支援を受けて、電子顕微鏡検査と Exo-PLA 実験およびデータ分析を実施しました。 MKM の監督を受けて論文を執筆しました。すべての著者が原稿の最終版に貢献しました。

マスード・カマリ・モガダムへの通信。

Ulf Landegren は Navinci および Olink Proteomics の株主であり、PLA テクノロジーに対する権利を持っています。他の著者は競合する利益を宣言していません。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: イブ・ロジャース。査読者レポートが利用可能です。

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Manouchehri Doulabi, E.、Fredolini, C.、Gallini, R. 他質量分析および近接アッセイによる前立腺由来細胞外小胞の表面タンパク質プロファイリング。 Commun Biol 5、1402 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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受信日: 2021 年 5 月 25 日

受理日: 2022 年 12 月 8 日

公開日: 2022 年 12 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04349-x

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