アフィニティマイクロ流体工学により、 - Pechino エポキシResin Co., Ltd.

Communications Biology volume 5、記事番号: 1147 (2022) この記事を引用

1288 アクセス

2 オルトメトリック

メトリクスの詳細

ユビキチン-プロテアソーム経路によって媒介されるタンパク質分解は、多くの生理学的および病理学的状態におけるシグナル伝達イベントを制御します。 in vitro 分解アッセイは、細胞増殖やその他の基本的な細胞プロセスがどのように制御されているかを理解するのに役立ちます。これらのアッセイは直接的で時間に依存し、非常に有益ですが、手間がかかり、通常は低スループットのポリアクリルアミドゲル電気泳動とそれに続くオートラジオグラフィーまたはイムノブロッティングに依存しています。我々は、無細胞抽出物中のタンパク質分解の発見と分析のためのMITOMIベースの統合マイクロ流体技術であるタンパク質分解オンチップ（pDOC）を紹介します。このプラットフォームには数百のマイクロチャンバーが収容されており、1 つまたは複数の物理化学的環境で微量の試薬を使用してタンパク質分解が迅速かつ同時に分析されます。基本的に、pDOC は、制御されたタンパク質分解に関連する生物医学およびトランスレーショナル研究に関連した、従来の分解アッセイに代わる高感度のマルチプレックスを提供します。

ユビキチン-プロテアソーム系によるタンパク質の分解は、すべての真核細胞のタンパク質レベルのバランスを維持する中心的な調節モジュールです。各タンパク質の所望の量からの逸脱は、いつでも細胞に有害であり、組織の機能不全や、がん、嚢胞性線維症、神経変性疾患などの幅広い疾患をヒトに引き起こす可能性があります1、2。

ユビキチン化の基礎となるコアカスケードには 3 つの酵素が関与します。E1 酵素はユビキチン分子に共有結合して活性化し、E2 結合酵素に転移します。次に、ユビキチン結合E2はE3ユビキチンリガーゼ酵素と相互作用し、通常はリジン残基へのイソペプチド結合を介して、E2から標的タンパク質へのユビキチン分子の移動を触媒します。反復的なユビキチン化イベントにより、標的タンパク質上に 1 つ以上のユビキチン部分の鎖が形成されることがあります (つまり、ポリユビキチン化)。プロテアソームによって認識されるポリユビキチン鎖は、タンパク質の分解を引き起こします1,2。何百もの異なる E3 酵素が、ユビキチン化プロセス全体の膨大な機能範囲と特異性を支配しています。細胞増殖と細胞周期制御に関しては、ユビキチンリガーゼ後期促進複合体/サイクロソーム (APC/C) と Skp1-Cullin-F-box タンパク質複合体 (SCF) が特に重要です 3,4,5。両方の複合体の基質特異性は、共活性化因子、すなわち、APC/C の場合は Cdc20 および Cdh1、SCF の場合はいくつかの F-box タンパク質の 1 つ、たとえば Skp2 および β-TrCP6、7、8 に依存します。全体として、細胞周期で調節される E3 酵素によって媒介される秩序あるタンパク質分解により、すべての真核生物において一方向性の細胞周期が保証されます 6、7、8、9、10。

ユビキチン鎖の一部の形式は、プロテアソームによる分解のためにタンパク質をマークしますが、モノユビキチン化および他の形式のポリユビキチン化は、プロテアソーム非依存性経路を介してシグナル伝達カスケードを調節します11。さらに、ユビキチン化は、タンパク質分解を防ぐことができる方法で、脱ユビキチン化酵素と呼ばれる酵素によって逆転させることができます12。逆に、プロテアソームの分解は常にユビキチン化と結びついているわけではありません 13。したがって、タンパク質の分解はユビキチン化から推測することはできず、直接決定する必要があります。

「無細胞システム」としても知られる無細胞抽出物におけるタンパク質分解アッセイは、細胞生物学の研究に役立っており、生理学的に関連する環境におけるユビキチン媒介タンパク質分解の直接的かつ定量的な分析を可能にします。実際、細胞周期の原理の多くは、カエルの卵または周期的なヒト細胞からの抽出物中の細胞周期タンパク質の分解をモニタリングすることによって発見されました（たとえば、14、15、16、17、18、19、20を参照）。今日の現代におけるこれらの「分解アッセイ」の広範な使用は、その有効性の証拠です (例 21、22、23 を参照)。興味深いことに、従来の分解アッセイは現代技術の恩恵を真に受けておらず、依然としてゲル電気泳動、オートラジオグラフィー、イムノブロッティング、および大量の生体物質に依存しています。

統合されたマイクロフルイディクスと空気圧マイクロバルブは、適切なタンパク質のフォールディングと活性を維持する網赤血球溶解物中でアレイ化されたタンパク質が新たに発現されるプロテインチップへの道を切り開きました24。標的タンパク質はオンチップまたは外部で発現され、その後、指定された表面化学を介してマイクロチャンバーに固定化されます。その後、微量の試薬を使用して、数千のマイクロチャンバーにわたって蛍光分析アッセイの大規模なパネルを実行できます。近年、我々は、タンパク質の翻訳後修飾（PTM）および非共有結合性相互作用の多重 in situ 解析のための、分子相互作用の機械的誘導トラッピング（MITOMI）に基づくいくつかのアプリケーションを開発しました24、25、26、27、28、29、30。

統合されたマイクロ流体工学、タンパク質アレイ、および無細胞システムの組み合わせは、生物医学研究において大きな可能性を秘めています。この研究では、無細胞抽出物におけるタンパク質分解の検出と定量化のための MITOMI ベースのプラットフォームを実証します。「pDOC」（タンパク質分解オンチップ）と名付けられたこの方法は、プロテアソーム媒介タンパク質分解をほぼ半世紀にわたってほぼ変わらずにin vitroでアッセイしてきた古典的な方法に代わる高速かつ多重的な代替手段を提供する。

pCS2-Flag-FA ベクターは、Flag タグオリゴをアニーリングし、BamHI および FseI 制限酵素 (RE) 部位を使用して最終フラグメントを pCS2-FA ベクターにライゲートすることによって生成しました。 pCS2-Flag-FA-Securin-GFP wt およびΔ64 変異体プラスミドは、FseI (5') および AscI (3') 隣接プライマーを使用して、wt または Δ64 Securin-GFP27 を pCS2-Flag-FA ベクターにクローニングすることによって生成しました。プラスミド pCS2-FA-Geminin-GFP が記載されています 27。 pCS2-FA-GemininΔ27-GFP は、FseI (5') および AscI (3') 隣接プライマーを使用して、メチオニン 28 のコドンから始まる Geminin-GFP のオープンリーディングフレーム (ORF) を増幅することによって生成しました。 PCR産物をpCS2-FAベクターに再クローニングしました。プラスミドｐＣＳ２－Ｆｌａｇ－ＦＡ－Ｇｅｍｉｎｉｎ－ＧＦＰｗｔおよびΔ２７変異体は、ＦｓｅＩおよびＡｓｃＩＲＥ部位を使用して、２つのＧｅｍｉｎｉｎ－ＧＦＰ変異体のそれぞれをｐＣＳ２－Ｆｌａｇ－ＦＡベクターにクローニングすることによって生成した。 Flag-p27-myc フラグメントは、pCS2-Flag-FA-p27-GFP テンプレート、Flag タグ (5') および Myc タグ (3') を含む最初のプライマーセット、およびT7 プロモーター (5') と T7 ターミネーター配列 (3') を含む第 2 のプライマーセット。モノマー Azami-Green (mAG) に結合したジェミニン N 末端 (110 アミノ酸) を、前述のテンプレート 31 と、FseI (5') および AscI (3') RE 部位に隣接するプライマーセットを使用して増幅しました。 PCR産物をpcS2FA-FLAGプラスミドにクローニングしました。後者は、突然変異誘発によってΔ27 バリアントを生成するためのテンプレートとして使用されました (Agilent の QuikChange® Lightning キット; 210513)。 K から A、および RxxL から GxxV への置換 (単一アミノ酸コード) は、突然変異誘発によって生成されました。詳細については、補足の表 1 を参照してください。 mAG-Geminin を除いて、すべての GFP タグ付きタンパク質は緑色蛍光タンパク質 (eGFP) の強化された変異体を保持していました。オリゴ配列については補足表 1 を参照してください。

NDB 細胞は HEK293 細胞株に基づいています。このセルシステムの詳細な説明は参考文献にあります。 17. NDB および HeLa S3 (ATCC; #CCL-2.2) 細胞は、10% ウシ胎児血清、2 mM L-グルタミン、および 1% ペニシリン - ストレプトマイシン溶液を添加したダルベッコ改変イーグル培地 (DMEM) を含む組織培養皿で維持されました。 (生物産業; #01-055-1A、#04-001-1A、#03-020-1B、#03-031-1B)。細胞は、加湿された 5% CO2 含有雰囲気中で 37 °C に維持されました。 HeLa S3細胞は、ディッシュ上または1リットルのガラス製スピナーフラスコ中で懸濁液（80 rpm）で培養しました。 NDB細胞を5μg/mlブラストサイジン(Life Technologies; #A11139-03)の存在下で培養して、TetリプレッサーのORFを保有するpcDNA6/TRプラスミドを維持した。

有糸分裂後期の同期化のために、NDB 細胞を直径 150 mm のディッシュで培養しました。約75%の集密度に達した後、細胞を1μg/mlテトラサイクリン(Sigma-Aldrich; #87128)で22時間処理し、抽出物調製のために回収した。 S 期の同期のために、HeLa S3 細胞を懸濁液中で 72 時間、約 5 × 105 細胞/ml の濃度まで培養しました。次に、細胞に 2 mM チミジンを 22 時間補充し、DMEM (2 回、5 分、250 × g) で洗浄し、あらかじめ温めた新鮮な培地 (37 °C) にさらに 9 時間放出しました。次いで、抽出物調製のために採取する前に、細胞培養物に２ｍＭのチミジンを１９時間再度補充した。

HeLa S3 抽出物: S 期の同期 HeLa S3 細胞を氷冷 1× PBS で洗浄し、膨潤バッファー (20 mM HEPES、pH 7.5、2 mM MgCl2、5 mM KCl、1 mM ジチオスレイトール [DTT]、プロテアーゼ阻害剤カクテル [Roche; #11836170001]) エネルギー再生混合物、E-mix (1 mM ATP、0.1 mM エチレングリコール-ビス [β-アミノエチルエーテル]-N,N,N',N'-四酢酸) を添加酸[EGTA]、1 mM MgCl2、7.5 mM クレアチンリン酸、50 μg/ml クレアチンホスホキナーゼ）。細胞を氷上で 30 分間インキュベートし、液体窒素中での凍結融解サイクルによって均質化し、21 G 針に 10 回通しました。その後の遠心分離 (17,000 × g、10 分および 40 分) によって抽出物を清澄にし、-80 °C で保存しました。 NDB 有糸分裂抽出物: Tet 誘導 NDB 細胞を 20 ～ 24 枚の 150 mm ディッシュから氷冷 PBS で穏やかに洗浄して収集しました。 HeLa S3 細胞について上述したように抽出物を調製しました。詳細については、17、32を参照してください。

標的タンパク質は、X線撮影検出用の35S-メチオニン/SL-システイン混合物（PerkinElmer; #NEG772002MC）またはタグなしメチオニンを補充したウサギ網状赤血球溶解物（TNT結合網状赤血球システム; Promega; #L4600、#L4610）を使用してin vitroで発現させました。 (プロメガ #L118A) および FluoroTect™ GreenLys (プロメガ #L5001)。

分解アッセイは、1μlの20×エネルギー再生混合物(上記参照)、1μlの10mg/ml Ub溶液(Boston Biochem; #U-100H)、および1μlの放射性標識インビトロ翻訳物を補充した20μlの細胞抽出物中で実施した。興味のあるタンパク質。陰性対照として、反応混合物にプロテアソーム阻害剤MG132 (20μM; Boston Biochem; #I-130)を添加した。反応混合物を 28 °C でインキュベートし、4 ～ 5 μl のサンプルを 15 ～ 20 分間隔で収集しました。オフチップ検出: 時点のサンプルを 4× Laemmli サンプルバッファー (BIO-RAD #1610747) と混合し、変性し (10 分間、95 °C)、SDS-PAGE によって分離しました。ゲルをメタノール/酢酸 (10/7.5%) 固定液に 20 分間浸し、真空および加熱で乾燥させ、蛍光スクリーン (Fuji) に 24 ～ 72 時間曝露しました。インビトロで翻訳されたタンパク質は、Typhoon FLA 9500 Phosphorimager (GE Healthcare Life Sciences) を使用したオートラジオグラフィーによって視覚化されました。シグナル強度（バックグラウンドシグナルについて補正）をImageJソフトウェアによって測定し、t0におけるシグナルに対して正規化した。すべてのプロットは、Microsoft Excel ソフトウェア、バージョン 16.20 を使用して作成されました。平均値と SE 値は、3 つまたは 4 つの独立した分解アッセイから計算されました。オンチップ検出: 時点のサンプルを液体窒素で直ちに凍結しました。検出前に、サンプルを氷上で解凍し、チップに 5 分間流し、「ボタン」バルブの下のタンパク質チャンバーに固定しました (下記の「表面化学」を参照)。次に、「ボタン」バルブを閉じて、結合していない物質を PBS で洗浄できるようにしました。標的タンパク質のレベル（分解反応の前後）は、488 nm 励起および 535/25 nm 発光フィルターによって測定されました。タンパク質レベルは、蛍光標識抗体（抗Flag-Alexa 647、μg/ml、#15009; Cell Signaling、Danvers、MA、USA）を使用した免疫蛍光によっても測定できます。これらの抗体をデバイスに流し込み、「ボタン」の下で固定化タンパク質とともに室温で 20 分間インキュベートしました。「ボタン」バルブを閉じた後、未結合の抗体を PBS で機械的に洗浄しました。ここで、標的タンパク質レベルは、633 nm 励起および 692/40 nm 発光フィルターによって決定されました。

マイクロ流体デバイスは 2 層の PDMS で構成されています。シリコンウェーハはフォトリソグラフィー (Heidelberg MLA 150) によって描画されます。その後、シリコンエラストマーポリジメチルシロキサン (PDMS、SYLGARD 184、Dow Corning、USA) とその硬化剤を使用してソフトリソグラフィーフェーズを実行し、マイクロ流体デバイスを製造します。マイクロ流体デバイスは、2 つの整列した PDMS 層、つまり異なる比率の PDMS とその硬化剤を使用して調製されたフロー層とコントロール層で構成されています。制御層とフロー層はそれぞれ 5:1 と 20:1。コントロール層を脱気し、80 °C で 30 分間焼きます。フロー層は最初に 2000 rpm で 60 秒間スピンコート (Laurell、USA) され、80 °C で 30 分間ベークされます。次に、フロー層とコントロール層を、立体視下で自動アライナ装置（カスタムメイド）を使用して位置合わせし、最終接着のために 80 °C で 1.5 時間ベークします。次に、2 層デバイスをウェハから剥がし、プラズマ処理 (空気、30%、30 秒) によってカバースリップガラスに貼り付けます。動作中、デバイスは Tygon® チューブを使用して空気圧マニホールドに接続され、プログラムされた一連のコマンドに基づいて自動的に動作します。

ビオチン化 BSA (1 μg/μl、Thermo) をデバイスに 25 分間流し、エポキシ表面に結合させます。ビオチン化BSAの上に、0.5μg/μlのNutraAvidin（Pierce、イリノイ州ロックフォード）を添加する（20分間流す）。次に、「ボタン」バルブを閉じ、ビオチン化 PEG (1 μg/μl、(PG2-AMBN-5k、Nanocs Inc.) を 20 分間流し、ボタン領域を除くフロー層を不動態化します。、「ボタン」バルブが解放され、0.2 μg/μl ビオチン化抗 GFP 抗体 (Abcam; #ab6658、ケンブリッジ、イギリス) または 0.01 μg/μl ビオチン化抗 Flag 抗体 (Cell Signaling; #2908 S Danvers) が流れます。、マサチューセッツ州、米国) を適用しました。抗体は露出したニュートラアビジン、特に「ボタン」の下の領域に結合し、抗 GFP または抗 Flag タグのアレイを作成しました。ステップ間の洗浄には PBS バッファーを使用しました。 p27 固定化の場合、0.2 μg/ml ロバ抗マウス全ビオチン化抗 IgG 抗体 (#715-065-150、Jackson Immuno Research Laboratories、メリーランド州、米国) を使用して表面化学を実行し、続いて 6.5 の 20 分間のフローを行いました。 μg/ml 抗 p27 抗体 (Santa Cruz biotechnology、ハイデルベルク、ドイツ; #1641 マウス)。

Flag-Securin-GFP (wt および Δ64 mut) および p27-GFP IVT 産物をチップに流し込み、GFP タグを介してタンパク質チャンバーの「ボタン」の下の表面に固定化し、続いて PBS バッファーで洗浄してスキャンしました。次に、「ボタン」バルブが開き、抽出反応混合物がタンパク質チャンバーとともに 60 分間 (30 °C) 培養されました。反応中、レマイニング標的タンパク質のレベルを 15 分ごとの GFP シグナルによって測定しました。 GFP シグナルの低下は分解と相関していました。バックグラウンドシグナルを差し引いた後、GFP シグナルを t0 (値 1) または 1 (最大シグナル) と 0 (最小シグナル) の間のシグナルに対して正規化しました。

画像の分析と表示には、LS リロードマイクロアレイスキャナー、GenePix7.0 (Molecular Devices)、および ImageJ 画像分析ソフトウェアを使用しました。ボタンバルブの周囲で測定されたシグナルは、そこではタンパク質の固定化が予想されなかったため、バックグラウンドとして考慮されました。ただし、デバイス表面への抗体の非特異的付着に起因するバックグラウンド信号が常に検出されます。 2 ピクセル間隔で 2 R のサイズのリング内のボタンの周囲のバックグラウンド信号を差し引きました (27 の補足資料を参照)。

タンパク質サンプルを x4 Laemmli バッファーと混合し、変性し (10 分間、96 °C)、Tris-グリシンランニングバッファーを使用して新しく作成した 10% アクリルアミドゲル上で分離しました。次に、Trans-Blot Turbo transfer system (Bio-Rad) を使用して、タンパク質をニトロセルロース膜 (Bio-Rad; #162-0115) に電気的に転写しました。 Ponceau S ソリューション (Sigma-Aldrich; #81462) を使用して、転送品質を検証しました。メンブレンを洗浄し（TBS）、ブロックし（TBST中の5％スキムミルク）、抗セキュリン（Abcam; # AB3305) 一次抗体 (RT、2 時間)。抗マウスホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体は、Jackson ImmunoResearch (#115-035-003) から購入しました。 ECL シグナルは EZ-ECL (Biological Industries; #20-500-171) を使用して検出されました。

全体として、実験計画と統計に関する詳細は、関連するセクションに記載されています。 P 値は、対応のない両側 t 検定に基づいて計算されました。ゲル内分析は 3 回繰り返して実行されます。プロットは平均値と標準誤差 (SE) 値を示します。オンチップ解析の統計は、n = 10 ～ 57 のセルユニットから得られました。平均値とSE値が表示されます。統計分析とグラフは、Microsoft Excel v16.65 ソフトウェアを使用して生成されました。

私たちは、in vitro でのタンパク質分解、特に無細胞系を分析するための複数の戦略をサポートするように pDOC を設計しました。このデバイスは、もともと平衡状態でのタンパク質-リガンド相互作用を定量化するために開発された MITOMI 統合マイクロ流体チップに基づいています 24,33。 MITOMI モジュールは、16 × 64、32 × 32、または 32 × 16 のマイクロコンパートメントのアレイを含むように変更されました。後者のチップは、並列ロードを可能にするために考案されたものでもあります (図 1a の回路図を参照)。各コンパートメント、すなわちセルユニット（図1b）は2つのチャンバーに分離され、3つのバルブによって制御されます。「ネック」バルブは、チャンバーIから「タンパク質チャンバー」への材料の拡散（混合）を制御します。特定の標的タンパク質が捕捉されます。セルユニット間を分離する「サンドイッチ」バルブ。そして、MITOMIの「ボタン」バルブは、その下で相互作用する分子を捕捉し、平衡状態での相互作用のスナップショットを取得します（図1b）。チャンバー I は 2 つの方法のいずれかでロードできます。 1) 「ゲル状」ロード。32 個のサンプルを順次または並行してロードできます。これは、マイクロバルブによって制御される一連の個別の入力チャネルによって実行されます。このアプローチの利点は、結果が得られるまでの時間が短いこと、比較的単純であること、従来のゲルベースのプロトコルと概念的に類似していることです。２）マイクロアレイローディング、すなわち、予めスポットされたオープンリーディングファーム（ＯＲＦ）がオンチップで転写されて、新たに発現されたタンパク質のアレイが生成される。このアプローチにより、スループットがスケールアップされます。同様に重要なことは、従来のアッセイと比較して試薬の消費量を少なくとも 3 桁削減できることです。各反応の体積は 1 ナノリットル未満です。次に、共通のマニホールドを使用して、デバイスの異なるセクションに共通の材料をロードします (たとえば、表面化学のため)。さらに、pDOC チップ設計には、3 つのバルブのマスター制御を、個別にアクティブ化して制御できるチップのセクションに分離することが含まれています。チップ全体の各バルブタイプの制御と比較して、この分離によりバルブ応答が改善されるだけでなく、より重要なことに、チップ上で時間応答アッセイが可能になります。各セクション内では、すべてのセルユニットで実験を並行して実行できるため、以前のデバイスで示した種類の多重アプリケーションが可能になります24、25、26、34。

pDOC は MITOMI ベースのマイクロ流体プラットフォームです。このデバイスには、フロー (緑) 層と制御 (マゼンタ) 層、およびいくつかのモジュールが含まれています。1) 材料のローディングを可能にする共通マニホールド。マイクロアレイと組み合わせると、最大 512 の異なる実験が可能になります。 2) 並列ローディング入力により、最大 32 の異なる実験条件のゲル状ローディングが可能になります。 3) 分解アッセイプロセスを制御する 512 セルユニットの MITOMI モジュール。 b 2 つのセルユニットの図。各セルユニット (黒い点線の枠でマーク) は、3 つの空気圧統合バルブによって制御される 2 つのチャンバーで構成されます。各ユニットの総体積は約 1 ナノリットルです。 2 つのチャンバーは「ネックバルブ」(I) によって分離されています。異なるセルユニットはサンドイッチバルブ (II) を介して分離されます。標的タンパク質を含むサンプル (IVT 製品) はプロテインチャンバーにロードされ、タンパク質またはタグに特異的なビオチン化抗体を介して固定化されます。標的タンパク質は MITOMI ボタンバルブ (III) を介して定量化のために捕捉され、結合していない残りの生体材料は洗い流されます。デバイス内の流れの方向は緑色の矢印で示されます。 c 左、MITOMI アレイ内のセルユニットの画像。標的タンパク質はタンパク質チャンバーに固定化され、いくつかの方法で定量化できます (右図): i) 検出用の蛍光タグ (GFP など) と非蛍光タグ (緑色に光るタグを参照) を保持する標的タンパク質の例固定化用の蛍光タグ。 ii) 固定化 (抗 GFP 抗体による) と検出の両方のために GFP でタグ付けされた標的タンパク質。 iii) 標的タンパク質はタグ付けされていません。検出は、in vitro 翻訳中に取り込まれた蛍光リジン (Lys) に基づいています。固定化はタンパク質特異的抗体を介して行われます。 iv) 標的タンパク質は、タグまたはタンパク質特異的抗体を介して固定化され、フルオロフォアに結合したタグ特異的抗体を介した免疫蛍光によって検出されます。全体として、標的タンパク質のオンチップ固定化はビオチン化抗体に依存しています。表面化学にビオチン化 IgG が含まれる場合、非ビオチン化抗体による固定化が可能です。

古典的な分解アッセイと同様に、pDOC 分析の標的タンパク質はウサギ網状赤血球溶解物を使用して in vitro 翻訳 (IVT) され、正しいフォールディングと翻訳後修飾 (PTM) が可能になります。 IVT 製品は、ビオチン-アビジン結合を介してチップのガラス表面に固定化されます。この目的を達成するために、特定のビオチン化抗体がボタンバルブの下に適用されます。標的タンパク質のプルダウンに続いて、網状赤血球溶解物や細胞抽出物などの未結合物質が洗い流されます。次に、ボタンの下の領域を除いて、チップ全体が PEG-Biotin によって不動態化されます (図 1b)。結合した標的タンパク質は蛍光定量的に定量されます。詳細については、以前の出版物 25、26、34 を参照してください。

このデバイスは、表面化学の複数の戦略および可能な実験セットアップと互換性があります (図 1c に示されています): 1) 標的タンパク質の N' 末端と C' 末端の両方にタグが付けられます。 1 つのタグはタグ特異的ビオチン化抗体による固定化に使用され、2 つ目のタグは検出に使用される蛍光タンパク質 (GFP など) です。 2) 固定化と検出の両方に蛍光タンパク質が使用されます。 3) 標的タンパク質は、蛍光リジン (green-Lys) を含むライセート中で翻訳され、タンパク質特異的抗体によって固定化されます。 4) 標的タンパク質は二重タグ化されています。ただし、ここでは 1 つのタグが固定化に使用され、2 番目のタグは蛍光抗体によって免疫検出可能です。重要なのは、表面化学にビオチン化抗 IgG も含まれる場合、非ビオチン化抗体でも固定化を実行できることです。タンパク質の固定化と定量化のこの柔軟性により、特定のニーズと制限、およびプラットフォームの全体的な多用途性に応じたアッセイの最適化が簡素化されます。

概念的には、pDOC によるタンパク質分解の分析は直接的、単純かつ迅速です。シグナル検出は in situ 定量に基づいているため、ゲル電気泳動やその他のゲル関連手順 (固定、乾燥、オートラジオグラフィーまたはイムノブロッティング、露出など) が不要になります。私たちの最初の目標は、pDOC のシグナル感度とダイナミックレンジにより、無細胞抽出液の分解がチューブ内、つまりオフチップでアッセイされた IVT 製品の時間ベースの定量化が可能かどうかを調べることでした。概念実証として、高レベルの非分解性サイクリン B1 により後期のような状態でブロックされる HEK293 細胞からの有糸分裂抽出物を利用しました。この有糸分裂無細胞系 (以下、NDB と呼びます) は、細胞周期タンパク質であるセキュリンおよびジェミニンの APC/CCdc20 媒介タンパク質分解を再現します 17,35。 NDB有糸分裂抽出物中の放射性標識Flag-Securin-GFPおよびFlag-Geminin-GFP（IVT製品）の従来の分解アッセイを図2aに示します（図S1も参照）。非分解性変異体バリアント (ジェミニン Δ27 およびセキュリン Δ64) を使用した対照実験では、アッセイの特異性が実証されています。同等の非放射性 IVT 製品を同様の方法でアッセイしました。まず、エンドポイントアッセイを実行しました (図 2b)。 NDB 有糸分裂抽出物と 60 分間インキュベートした後、反応サンプルを別のチャネルを通じて pDOC にロードし、GFP 蛍光をスキャンしました。 IVT産物をPBS中でインキュベートした対照反応により、t60分における各標的タンパク質のレベル(抽出物/PBS比)を正規化し、バックグラウンドシグナルを推定することができました。全体として、オンチップ検出では、NDB 有糸分裂抽出物でのインキュベーション後のジェミニンとセキュリンのレベルの急激な低下が示されていますが、非分解性バリアントは安定したままであり、PBS 中でコントロール GFP シグナルの約 80% を示しています。この時点で、網赤血球溶解物、細胞抽出物、および非特異的固定化からのバックグラウンドシグナルが小さいことに気づきました（図S2）。

a E-mix とユビキチンを添加した NDB 有糸分裂抽出物 (20 μl) 中の 35S 標識 Flag-Securin-GFP、Flag-Geminin-GFP およびそれらの非分解性バリアント (それぞれ Δ64 および Δ27) の時間依存性分解。時間依存性のタンパク質分解は、SDS-PAGE およびオートラジオグラフィーによって解析されました。 b 非放射性 IVT 製品を使用して同等のアッセイを実施しました。標的タンパク質を、抽出物または PBS (コントロール) を含む反応溶液中で 1 時間インキュベートしました。次に、各反応混合物のアリコート (5 μl) を、それぞれ数十の細胞ユニットを含む個別のチャネルを介してチップに直接ロードしました。標的タンパク質は、ビオチン化抗 GFP 抗体を介してタンパク質チャンバーに固定化されました。 GFP タグも定量化に使用されました。 GFP シグナルは、反応条件ごとに標的タンパク質あたり 14 ～ 19 細胞単位から計算されました (抽出物対 PBS)。箱ひげ図は、t60 分での GFP シグナル (抽出物/PBS) の比を示しています。平均値 (x) と中央値 (-) が表示されます。 *p 値 < 0.001。 4 つの標的タンパク質のチップ上での検出を示す代表的な生データが示されています。 c Flag-Securin-GFP バリアントの分解は、B に記載されているようにチューブ内でアッセイされました。ただし、ここでは、アリコートを 15 分ごとに瞬間冷凍しました。次に、微速度撮影サンプルを分析のためにチップにロードしました。標的タンパク質は抗GFP抗体を介してタンパク質チャンバーに固定され、GFP蛍光に基づいて定量されました。野生型セキュリンと変異型セキュリンの時間依存性分解は、35S シグナル (標準分析; n = 3] および GFP 蛍光 (オンチップ分析) に基づいて定量化されました。プロットは平均シグナルと標準誤差バーを示しています。平均シグナルは 26 個の細胞から計算されましたd Flag-Geminin-GFP を使用して実行された (c) と同等の実験。ただし、固定化が抗 Flag 抗体に基づいていたことを除き、n = 30 ～ 40 細胞単位。

次に、pDOC を利用してタンパク質分解に関する信頼できる速度論情報を取得できるかどうかをテストしました。 Flag-Securin-GFP および Flag-Geminin-GFP を NDB 有糸分裂抽出物中で 60 分間インキュベートし、反応サンプルを 15 分ごとに液体窒素中で瞬間凍結しました。急速解凍後、シグナル定量化のために 5 つの時点を表すサンプルをチップにロードしました。同等の分析を、SDS-PAGE およびオートラジオグラフィーを使用して実行しました。非分解性 Flag-SecurinΔ64-GFP および Flag-GemininΔ27-GFP 変異体も、対照としてオートラジオグラフィーによってアッセイされました。 2 つの検出方法間の大きな違いを考慮して、GFP およびオートラジオグラフィーのシグナルは 0 と 1 の間で正規化されました。これは、t60 分のシグナルが他のすべての時点から差し引かれることを意味します。結果の値は、t0 での最大信号に対して正規化され、プロットされました。図2c、dに示すように、pDOCによるオンチップ分析とSDS-PAGEオートラジオグラフィーによるオフチップ分析は、Flag-Securin-GFPとFlag-Geminin-GFPのほぼ同一の分解パターンを示しました。反応カクテルには、1μlのIVT、20μlの抽出物、および2μlのユビキチン/Eが含まれていたことに注意してください。当社の標準プロトコルに従って、溶液を混合します17、27、36。各時点で、ネックバルブを閉じた状態で、MITOMI ボタンバルブを開いたタンパク質チャンバーに 5 μl の反応混合物を 5 分間流し、標的タンパク質の固定化を可能にしました。このローディングプロトコルにより、信号飽和を気にすることなく、ターゲットタンパク質を明確に視覚化することができました（図S3）。我々は、pDOC が in vitro でのタンパク質分解のエンドポイント分析と時間経過分析の両方を容易にするという結論に達しました。重要なことは、Flag-Securin-GFP は、抗 Flag 抗体ではなくビオチン化抗 GFP 抗体を介してタンパク質チャンバーに固定化されたことです。そうすることで、GFP が固定化と検出の両方に機能し、2 つのタグの必要性がなくなることを効果的に実証しました。全体として、GFP はオンチップの信号検出に最適なタグであることがわかりました。

しかし、蛍光タンパク質と標的タンパク質の融合は、タンパク質分解を効果的に制限する方法でタンパク質のフォールディングを歪める可能性があります。したがって、場合によっては、蛍光タンパク質タグに依存しないタンパク質の定量化が重要になる可能性があります。これに関連して、pDOC の柔軟性は特に有利です。図 3a は、セキュリンの分解をオンチップで記録できる 2 つの代替構成を示しています。1) green-Lys による直接検出。 2) in situ 免疫蛍光による間接的検出。セキュリンレベルをt0およびt60分に測定した。どちらのアプローチも有益であり、NDB 有糸分裂環境におけるセキュリンの分解を明確に明らかにしました。直接検出に関しては、GFP でタグ付けされた IVT 製品が、green-Lys で標識された同等のタンパク質よりも全体的に明るいことは注目に値します。しかし事実上、この実験は、組み込まれたgreen-LysがLys残基の化学修飾に基づくタンパク質分解をブロックしないことを実証している37。免疫蛍光による間接検出は本質的に 2 つのタグに依存しており (単一のタグを免疫標識と固定化の両方に使用することはできません)、さらに 30 分間のインキュベーションが必要です。しかし、標準的な免疫検出可能なタグはサイズが小さいため、タンパク質のミスフォールディングのリスクが最小限に抑えられ、抗体が結合している市販の蛍光団から発せられる明るいシグナルが有利です。

a NDB 有糸分裂抽出物中の Flag-Securin-Myc、Flag-Securin-GFP、および Green-Lys 標識 Flag-Securin (IVT 製品) の分解をチューブ内で 1 時間アッセイしました。オンチップ分析は複数の方法で実行されました。1) Flag-Securin-Myc は抗 Myc 抗体によって固定化され、抗 Flag Cy5 結合抗体によって検出されました。 2) Flag-Securin-GFP を固定化し、GFP タグを介して検出しました。３）Green-Lys標識Flag-Securinを抗Flag抗体を介して固定化し、Green-Lysシグナルにより検出した。抗 Myc/Flag/GFP 抗体はビオチン化されています。プロットと生データは、t0 分と t60 分のタンパク質レベルを示しています。信号は t0 での最大値に正規化されます。平均値と標準誤差バーが表示されます。 n = 20 ～ 40 セルユニット。 *p 値 < 0.001。 b Green-Lys標識p27（タグなし）およびFlag-Securin-GFPの分解をS期抽出物中でアッセイし、pDOCによって分析しました。 p27は、ビオチン化抗マウスIgGおよび抗p27抗体を介して固定化されました。 Green-Lys シグナルを検出に使用しました。 Flag-Securin-GFP はビオチン化抗 Flag 抗体を介して固定化されました。細胞抽出物とのインキュベーション後、タンパク質レベルを 15 分間隔で GFP または Green-Lys 蛍光によって定量しました。プロットは、t0 での最大信号に対して正規化された平均誤差値と標準誤差値を示しています。 n = 20 (p27) および 10 (セキュリン) 細胞単位。

pDOCの多用途性は、タグフリーp27を使用してさらに実証されました（図3b）。 p27 の分解は、APC/C ではなく SCFSkp2 E3 リガーゼによって媒介され、細胞周期の DNA 合成 (S) 期と調整されます 38。 p27 分解は、S 期同期 HeLa S3 細胞からの抽出物でアッセイされ、pDOC によって分析されました。タンパク質は、抗 p27 およびビオチン化抗 IgG 抗体を介して固定化され、green-Lys によって検出されました。 pDOCによる分析により、S期抽出物中のp27の典型的な不安定性が明らかになりました（図3b）。分解パターンはオートラジオグラフィーで測定されたものと似ていました（図S4）。したがって、pDOC はタグのないタンパク質の分解アッセイに利用できます。さらに、この方法は特異的であり、特定のタイプの無細胞系に限定されません。

オートラジオグラフィーに基づく分解アッセイの利点には、高いシグナル対ノイズ比、シグナルの高い特異性、およびアッセイの直線性が含まれます。ただし、これにはコストがかかります。まず、35S 同位体は半減期が約 3 か月の短命試薬です。次に、ゲル上でシグナルは幅 4 ～ 5 mm のウェル (標準 10 ウェルゲル) に広がります。第三に、標準的な分解アッセイでは、1 ～ 2 μl の IVT 製品を、タンパク質濃度が約 20 ～ 25 mg/ml である 20 ～ 30 μl の細胞抽出物で希釈します。したがって、レーンごとにロードされる IVT の量は、ゲルの最大分離能力によって制限されます。通常、厚さ 1 mm の標準的な 10 ウェルミニゲルのウェルに 4 ～ 5 μl の反応混合物をロードします。第 4 に、リボソームの処理能力のため、大きなタンパク質の in vitro 翻訳は困難です。したがって、大きなタンパク質には小さなタンパク質に比べてより多くの放射性標識メチオニン/システインが組み込まれていますが、完全長タンパク質の全体的なシグナルは信頼性の高い定量化には実用的ではない可能性があります。第 5 に、高品質信号に必要な露光時間は通常 12 ～ 24 時間の範囲内です。タンパク質分解を SDS-PAGE およびイムノブロッティングでアッセイする場合、上記のポイント 2 ～ 4 は同様に関連することに注意してください。ポイント 5 に関しては、イムノブロッティングは長時間露光を必要としません。ただし、抗体との全体的なインキュベーション時間は長くなります。さらに、免疫ブロットベースのアッセイにおける IVT 産物は、抽出物中の内因性タンパク質と区別するためにタグ付けする必要があります。この時点で、分解をオートラジオグラフィーまたはイムノブロッティングで分析するかどうかにかかわらず、IVT 産物の有益な発現は、それ自体 1 日がかりの手順で事前に検証する必要があることに注意することが重要です。 pDOC による同等の検証は瞬時に行われます。

オンチップでは、t60 分の時点での Flag-Securin-GFP の蛍光シグナルはバックグラウンドレベルを上回り、オートラジオグラフィーと比較してより顕著でした (図 2a および 3a)。しかし、t60分のシグナルを他のすべての時点から差し引くと、pDOCおよびオートラジオグラフィーによって明らかになったFlag-Securin-GFPの全体的な分解パターンは同様でした（図2c、d）。この観察は、pDOC が、60 分間のインキュベーション後も反応混合物中にまだ残っており、オートラジオグラフィーではほとんど検出されないタンパク質残基を検出することを示唆しています。したがって、pDOC の感度は従来のオートラジオグラフィーの感度を上回っていると主張でき、もしそうなら、pDOC は in vitro 分解アッセイを容易にするだけでなく、試薬の消費量とアッセイごとのコストも大幅に削減します。それをテストするために、網赤血球ライセートで Flag-Securin-GFP を 4 倍および 10 倍に希釈し、元の網赤血球ライセート / 抽出物の体積比 1/20 (μl) を維持しながら、基質を NDB 有糸分裂抽出物中で 1 時間インキュベートしました。時点サンプルは、pDOC (GFP 蛍光に基づく) によって分析されました。従来のアッセイに従って、35S標識Flag-Securin-GFPを用いて同等の実験を並行して実施した(図4およびS5)。明確にするために、放射性標識基質と非放射性標識基質は、同じ TNT®/DNA 溶液混合物から同時に発現されました。さらに、35S-Met/35S-Cys 溶液 (約 1175 Ci/mmol) を研究室に配送した翌日に分解アッセイを実施し、ゲルを一晩蛍光スクリーンに曝露しました。それでも、IVT基質を希釈するたびに、オートラジオグラフィーによって得られたシグナルは、t0であっても許容可能な基準を下回り、15分間のインキュベーション後にはかろうじてまたは検出できないレベルまで減少しました（図4aおよびS5）。逆に、pDOC による分析は 3 つの条件すべてで有益でした (図 4b)。 4 倍および 10 倍に希釈した Flag-Securin-GFP の本物のシグナルを t0 および t60 分で検出することができ、NDB 有糸分裂抽出物中のタンパク質の完全な動態を記録しました。より実際的な点では、0.1 μl の IVT 製品と 2 μl の細胞抽出物を使用してタンパク質分解を分析できることを効果的に実証し、それにより試薬の 90% を節約しました。この特徴は、初代細胞からの抽出物や正常/病理学的組織サンプルなど、限られた生物学的材料に依存するアッセイにおいて特に価値があります。

NDB 有糸分裂抽出物中の 35S 標識 Flag-Securin-GFP の時間依存性分解アッセイ。アッセイは、未希釈の IVT 製品 (100%) または網赤血球溶解物での 4 倍/10 倍希釈 (それぞれ 25 および 10%) を使用して実行されました。すべてのアッセイにおいて、1 μl の基質を 20 μl の細胞抽出物中でインキュベートしました。サンプルを 20 分間隔で急速冷凍し、SDS-PAGE およびオートラジオグラフィーによって分析しました。 b 非放射性Flag-Securin-GFPを用いて行われた同等の分解アッセイ。固定化 (抗 GFP ビオチン化抗体による) および検出 (GFP 蛍光) のために、時点のサンプルをチップにロードしました。プロットは、実験ごとに 15 ～ 20 セル単位の 3 つの実験からのデータを要約しています。正規化された平均値と標準誤差値が表示されます (左)。代表的な生データを右側に示します。

pDOC は、従来の方法では視覚化できなかった Flag-Securin-GFP の残留量を明らかにします。興味深いことに、3 つの条件すべてにおける Flag-Securin-GFP の全体的な分解パターンは類似していましたが、基質濃度が低下するにつれて Flag-Securin-GFP 分解が系統的に遅延することに気づきました。この観察は私たちの研究室ではこれまで確認されておらず、セキュリン、そしておそらくは APC/C 基質全体のユビキチン化/分解のプロセスに沿った律速段階に起因する可能性があります 39,40。反応混合物中の Flag-Securin-GFP の推定濃度は 17 nM であったことに注意してください (網赤血球溶解物でさらに希釈する前;図 S6)。

これまで、我々はチューブ内、つまりオフチップで行われるタンパク質分解反応の分析を容易にする pDOC の能力を実証してきました (図 2 ～ 4)。ただし、技術的には、ネックバルブと MITOMI ボタンバルブにより、各細胞ユニット内の標的タンパク質と無細胞抽出物の時間制御された混合が可能になります。より具体的には、ターゲットタンパク質のローディングと固定化は、クローズドネックバルブを使用して実行されます。標的タンパク質が閉じたMITOMIボタンの下にトラップされると、細胞抽出物をチップに流すことができます。このステップは、開いたネックバルブで実行され、細胞抽出物がチャンバー I に到達することを可能にします。その後、ネックバルブを再度閉じることにより、細胞抽出物をチャンバー I (ここでは「抽出チャンバー」と表記) に捕捉することができ、その後、すべての残りの物質が洗い流されます。ネックバルブと MITOMI ボタンバルブの両方が開くと、分解反応が開始します (t0)。細胞抽出物はタンパク質チャンバー内に拡散し、露出した標的タンパク質に到達します（図 5a に示す）。このパイプラインにより、タンパク質分解の完全なオンチップアッセイが可能になる可能性があります。オンチップアッセイの動機は 3 つあります: 1) 試薬の節約とアッセイあたりのコスト。実際、5 μl の細胞抽出物は 1,000 個の細胞ユニットを満たすのに十分です。 2) リアルタイムでのタンパク質分解の分析。 3) 以前に実証されたように、特に標的タンパク質がオンチップで発現される場合、スループットが向上します25、26、27。ただし、課題は、細胞単位あたり抽出物が 1 nl 未満という限られた分解能力であり、どのプラットフォームでもテストされていません。私たちは、チップ上でのタンパク質分解の実現可能性をテストすることにしました。この目的を達成するために、Flag-Securin-GFP および Flag-p27-GFP (IVT 製品) の野生型および非分解性変異体を (別のチャネルを通じて) チップにロードし、ビオチン化を介して MITOMI ボタンバルブの下のタンパク質チャンバーに捕捉しました。抗GFP抗体。洗浄後、NDB 有糸分裂抽出物を抽出チャンバーにロードし、ネックバルブを閉じることによってトラップしました。捕捉されなかった物質は洗い流されました。デバイスを 30 °C に加熱し、スキャンして t0 の信号を取得しました。ネックとMITOMIボタンバルブを開くと、すべてのセルユニットで同時に分解反応が開始され（図5a、b）、チップは15分の時間間隔でスキャンされました。非分解性セキュリン p27 および GFP 自体の蛍光シグナル (図 S7) は、実験全体を通して NDB 有糸分裂抽出物中で安定したままでしたが、Flag-Securin-GFP のシグナルは時間とともに減少しました (図 5c)。これにより、有糸分裂環境におけるこのタンパク質の制御されたタンパク質分解が明らかになりました。

a、b pDOC による完全なオンチップ分解アッセイの概略図。 IVT タンパク質産物は、抗 GFP ビオチン化抗体を介して「タンパク質チャンバー」の表面に固定化されます (詳細は図 1 を参照)。 MITOMIボタンのバルブを閉じることでタンパク質をトラップします。すべての残留物をＰＢＳで洗い流す。標的タンパク質の適切な発現と固定化はスキャンによって検証されます。次に、無細胞抽出物を抽出チャンバーにロードし、ネックバルブを閉じてトラップします。反応はネックバルブと MITOMI ボタンバルブを開くことで始まり、細胞抽出物が「タンパク質チャンバー」に拡散し、標的タンパク質と混合します。チップを 30 °C のホットプレート上に置き、15 分間隔でスキャンして、リアルタイムで動態情報を提供します。 c GFPタグ付きセキュリンおよびp27 IVT産物を、抗GFPビオチン化抗体を介して固定化しました。次に、抽出物チャンバーを、セキュリンのユビキチン化をサポートするが、その非分解性変異体 (Δ64) および p27 (アッセイ特異性を検証するネガティブコントロール) のユビキチン化はサポートしない NDB 有糸分裂抽出物で満たしました。タンパク質分解を 1 時間アッセイし、その間チップを 5 回スキャンしました。プロットは、t0 および標準誤差バーに正規化された平均 GFP シグナルを示しています。 n = 14 ～ 30 セルユニット。 p27 とセキュリンの代表的な生データを右側に示します。

リジンは、ユビキチン化や、それほど単純ではない方法でタンパク質の分解を制御する可能性のある他の多数の PTM の主要な部位です。我々は、pDOC の多重化能力を利用し、有糸分裂環境におけるジェミニンの全体的な分解に対するリジン残基の寄与をテストしました。ジェミニンの分解を制御するシスエレメントは、タンパク質の N 末端に位置しています。実際、Geminin の最初の 110 アミノ酸に結合した単量体 Azami-Green (mAG) 蛍光タンパク質 (mAG-Geminin) は、細胞における APC/C 活性のよく知られたマーカーです 31,41。我々は、Flagタグ付きmAG-Geminin（以下、「Geminin-degron」と呼びます）を構築し、単一のリジン（K）残基がアラニン（A）に置換された変異変異体のパネルを生成しました。破壊ボックス配列23RxxL26,42がGxxV（単一アミノ酸コード）に置換された非分解性変異体も構築された（図6a）。 NDB 有糸分裂抽出物中のすべてのバリアントの分解を最初にオンチップでアッセイしました (技術的な詳細については図 5 を参照)。 IVT産物はビオチン化抗Flag抗体を介してチップに固定され、t0およびt60分でmAG蛍光によって定量されました。これらの時点間のシグナル比は、0と1の間で正規化されました。すなわち、重量（0）と非分解性（1）のジェミニンデグロンについて計算された比です（図6b）。次に、突然変異体のサブセットをオフチップ分解反応に供し、続いてオンチップ分析を行った（図6c、より技術的な詳細については図2を参照）。同様の分解傾向が両方のエンドポイントアッセイで観察されました (図 6d)。同じ戦略が信号の定量化と正規化に使用されることに注意してください。重要なことに、2 つのアッセイでは、NDB 有糸分裂抽出物中の K50A バリアントの分解能力が限られていました。 K50A変異体の部分的な安定性は、時間依存性の分解分析によってさらに検証されました（図6e）。この目的を達成するために、チューブ内の分解反応を 20 分ごとにサンプリングし、オンチップで分析しました。興味深いことに、限定された分解または K50A バリアントは、SDS-PAGE およびオートラジオグラフィーでは検出できませんでした (図 6f および S8)。この不一致は、2 つの方法の感度の違いと、より少量の基質を検出する pDOC の能力によって説明できます (図 4)。総合すると、我々の発見は、リジン 50 がジェミニンの分解に寄与していることを示唆しています。現時点では、リジン 50 がポリユビキチン化されているかどうかは不明です。しかし、このモデルに従えば、ジェミニンのユビキチン化は明らかにリジン 50 に限定されず、そうでなければ K50A 変異体は NDB 有糸分裂抽出物中で安定なままであったでしょう。より一般的には、図 6 に示したデータは、pDOC によるタンパク質分解の体系的な分析を示しています。

a FlagとmAGのタグがつけられた「ジェミニン・デグロン」のイラストです。ライシンと破壊ボックス (D-box) のコア要素 (RxxL) は 1 文字のアミノ酸コードで示されます。変異体は、単一のリジン残基をアラニンに置換することによって生成されました。 D-box 変異体 (DBM) ジェミニンは、それぞれ 23 位と 26 位にグリシンとバリンを持っています。 b チップ上の Geminin-degron バリアントのエンドポイント分解分析。破線はカットオフ値（すなわち、t0におけるwtジェミニン-デグロンの4標準偏差）を表し、この値を超えるとさらなる分析のために変異体にフラグが立てられる。 c 選択されたジェミニンデグロンバリアントのエンドポイント分解分析。分解反応はチューブ内で実行され、タンパク質レベルはチップ上で定量化されました (技術的な詳細については図 2 を参照)。 b、c t60分におけるジェミニン-デグロン変異体の正規化レベルがプロットされています。 n = 12 ～ 38 (b) および 21 ～ 57 (c) セル単位。 d B と C に示されているデータ間の線形相関。平均値と標準誤差値が示されています。 e、f ジェミニンデグロンバリアント（チューブ内）の時間依存性分解を、SDS-PAGEおよびオートラジオグラフィーによってチップ上で分析しました（e; n = 16〜25セルユニット）（f;代表的な生データを左側に示します。 n = 3)。すべての分解反応は NDB 有糸分裂抽出物に含まれています。

pDOC は、生理学的に関連する状況におけるタンパク質分解の発見と分析を促進および簡素化するために考案されたラボオンチッププラットフォームです。このチップには数百のマイクロチャンバーが収容されており、そこでタンパク質の分解を迅速かつ同時に分析できます。ただし、pDOC の動機と必要性は、そのハイスループットの可能性をはるかに超えていることを強調することが重要です。1) 従来のアッセイと比較して、かなり少ない量の試薬で分析を実行できます。後者の特徴は、生産が時間、活性、量の点でボトルネックとなる可能性がある無細胞抽出物、たとえば、世界的/個人的な生物医学研究を目的とした貴重な正常/悪性組織サンプルを起源とする細胞抽出物にとって特に重要です。診断; 2) シグナル検出は、蛍光シグナルの in situ 定量化に基づいています。この方法は汚染された放射性物質とは無関係でありながら、従来のアッセイを上回る感度を備えています。 pDOC と従来の分解アッセイの比較を図 7 に示します。pDOC の柔軟性は非常に優れています。このプラットフォームは、ほぼすべての可能な実験計画を容易にします。まず、Green-Lys、蛍光タンパク質、または免疫検出可能なタグの取り込みに基づく検出により、タグ付きタンパク質とタグなしタンパク質の両方をアッセイできます。第二に、pDOC は、少量のオフチップ分解反応を即時に分析するための統合マイクロ流体カラムとして使用できます (図 2、3)。 2 つのローディングモジュールを統合することで、数十の反応溶液をチップ上に同時にロードできます。標的タンパク質は精製され、セルユニットのタンパク質チャンバー上で濃縮され、数分から 1 時間以内 (検出プロトコルに応じて) でオフチップ分解のオンチップ検出が可能になります。あるいは、タンパク質分解を完全にオンチップでリアルタイムにアッセイすることもできます。 pDOC のこの機能は、ナノリットル未満の体積でタンパク質分解をテストできるためだけでなく、MITOMI ベースのデバイスとオンチップの in vitro 翻訳との固有の互換性のために重要です 24,25,27。オンチップで一連のタンパク質を発現させることで、数十から数百の標的タンパク質を多重化し、スループットを劇的に向上させることができます。オンチップ発現の欠点は、DNA マイクロアレイを備えたデバイスの組み立てが簡単ではなく、現在は専門の研究室の専門家によって行われなければならないことです。全体として、pDOC の多重特性は両側性です。1 つの反応溶液を数十または数百の異なるタンパク質に適用したり、1 つまたは多数のタンパク質の分解を複数の物理化学的条件で同時にテストしたりできます。この品質は、オンチップとオフチップの両方の劣化反応の分析に関連します。

すべての方法の目的は、無細胞抽出物、組換えユビキチンおよびエネルギー再生混合物 (E. ミックス) を含む反応混合物中の IVT タンパク質生成物のタンパク質分解をアッセイすることです。標準アッセイ (赤色のパイプライン) は通常、放射性です。 35S 標識 IVT 製品 (1 ～ 2 μl) を 20 ～ 50 μl の反応混合物と混合し、30 ～ 90 分間インキュベートします。各時点で、反応混合物のアリコート (約 5 μl) が収集されます。サンプルは変性され、SDS-PAGE によって分離されます。乾燥後、ゲルは蛍光体スクリーンにさらされます。通常、満足のいく信号は一晩で得られます (ON)。さまざまな理由により放射性シグナルが低い場合には、より長い曝露 (24 ～ 72 時間) が必要になることがよくあります。 pDOC は 2 つの代替アッセイ (青色のパイプライン) を提供しており、どちらにも利点があります。戦略 I: 分解反応はオフチップで実行されます。標的タンパク質は、標準タグ (例: GFP、Flag、Myc など) に融合されるか、Green-Lys の存在下で翻訳されます。時点のサンプルは、順番にチップにロードされるか、最初に煮沸/瞬間冷凍されてから同時にロードされます。標的タンパク質はタグ/タンパク質特異的表面抗体によって固定化され、他のすべての物質は洗い流され、図 1c に詳述されている戦略の 1 つによってほぼ瞬時に定量化が実行されます。戦略 II: ここでは、標的タンパク質と細胞抽出物がチップ上に連続してロードされ、各細胞ユニット内の別々のチャンバーを占めます。 2 つの武道を混ぜることで反応が始まります。微速度撮影スキャンにより、動的な情報が得られます。戦略 I はより単純ですが、戦略 II はハイスループット実験に最適です。どちらのオンチップ戦略も試薬を節約でき、標準アッセイよりも大幅に時間がかかります。

ユビキチン媒介タンパク質分解は、世界中の何百もの研究室で日常的に分析されています。さらに、これは治療法 (Velcade® など) および薬剤設計 (Nurix Therapeutics など) の主要なシグナル伝達経路です。我々は、準細胞環境におけるタンパク質分解の in vitro 分析を容易にし、簡素化するために pDOC を考案しました。このメソッドは高速、高感度、試薬の節約に優れ、低スループット研究と高スループット研究の両方に適しています。プラットフォームの完全な自動化が予見可能であることも注目に値します。したがって、私たちは、pDOC が標的タンパク質分解の基礎研究およびトランスレーショナル研究にとって価値のあるツールであると信じています。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Research レポートの概要をご覧ください。

この研究中に生成または分析されたデータは、この公開された論文 (およびその補足情報ファイル) に含まれています。図および補足図のソースデータは、補足データ 1 (図) と補足データ 2 (補足図) の 2 つの .xlsx ファイルで提供されます。

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試薬を共有してくれた Gerber と Tzur 研究室のメンバーに感謝します。 Tzur 研究室は、イスラエル科学財団 (ISF) の助成金第 2 号によって支援されています。 2038/19。 Gerber ラボは、Imageomics FET European Grant No. 205761 によってサポートされています。

これらの著者は同様に貢献しました: Lev Brio、Danit Wasserman。

この作品は、Doron Gerber 氏、Amit Tzur 氏が共同で監修しました。

ミナ＆エヴェラード・グッドマン生命科学学部およびバー・イラン大学ナノテクノロジー先端材料研究所（イスラエル、ラマトガン）

レフ・ブリオ、ダニット・ワッサーマン、エフラット・ミカリー＝バルビロ、ガル・バラザニー＝ガル、ドロン・ガーバー、アミット・ツル

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LB、DW、EMB、DG、および AT が設計した研究。 LB、DW、EMB が調査を実施しました。 LB、DW、EMB、GBG、DG、および AT は、新しい試薬または分析ツールに貢献しました。 LB、DW、EMB 分析データ。 DW、LB、EMB、DG、AT がこの論文を執筆しました。

ドロン・ガーバーまたはアミット・ツルとの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

すべての著者は、すべての原稿の内容、著者リストとその順序、および著者の寄稿文に同意したものとします。

Communications Biology は、この研究の査読に貢献してくれた匿名の査読者に感謝します。主な取り扱い編集者: Gene Chong。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

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転載と許可

Brio, L.、Wasserman, D.、Michaely-Barbiro, E. 他アフィニティーマイクロフルイディクスにより、無細胞抽出物におけるハイスループットのタンパク質分解分析が可能になります。 Commun Biol 5、1147 (2022)。 https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

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受信日: 2021 年 8 月 27 日

受理日: 2022 年 10 月 12 日

公開日: 2022 年 10 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-022-04103-3

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