ATG7 と ATG14 はヒトマクロファージにおける結核菌のサイトゾルおよびファゴソームの複製を制限します

Nature Microbiology volume 8、pages 803–818 (2023)この記事を引用

5754 アクセス

1 引用

182 オルトメトリック

メトリクスの詳細

オートファジーは、結核菌 (Mtb) などの細胞内微生物に対する細胞の自然免疫防御機構です。正統的および非正統的オートファジーがファゴソームおよびサイトゾルにおけるMtb感染を制御するためにどのように機能するかは未解決のままである。マクロファージは、Mtb のヒトにおける主な宿主細胞です。今回我々は、一般的な実験室株H37Rvと同じ遺伝的背景で生成された一連のMtb変異体を用いて、遺伝的に扱いやすいヒト人工多能性幹細胞由来マクロファージ（iPSDM）における標準オートファジーと非標準オートファジーの寄与を研究した。われわれは、ATG7 または ATG14 のいずれかを欠く iPSDM において、標準オートファジーを誘発できない (Mtb ΔesxBA)、または非標準オートファジーをブロックできないと報告されている (Mtb ΔcpsA) 変異体の複製を、単一細胞ハイコンテンツイメージングを使用してモニタリングしました。 iPSDM における CRISPR-Cas9 による ATG7 の欠失により、野生型 Mtb の複製が増加しましたが、Mtb ΔesxBA または Mtb ΔcpsA の複製は増加しなかったことを報告します。我々は、ATG14 の欠失により野生型 Mtb と変異型 Mtb ΔesxBA の両方の複製が増加することを示します。 Mtb レポーターと定量的イメージングを使用して、Mtb を含むファゴソームとリソソームの融合を制御する際の ATG14 の役割を特定し、それによって細胞内細菌の制限が可能になりました。我々は、ATG7とATG14は両方ともヒトマクロファージにおけるMtb複製の制限に必要であると結論づけた。

2 つの主要なオートファジー経路が、細胞内病原体に対する宿主防御に関与していると考えられています。それは、ゼノファジーの標準経路 1,2,3 と、LC3 関連食作用 (LAP) と呼ばれる非標準経路 4,5 です。ゼノファジーはマクロオートファジーの特殊な形式であり、新たなオートファゴソーム生合成により、リソソームを標的とした二重膜オートファゴソーム内の細菌を捕捉します6。ファゴソームを含む細菌の破裂は、ガレクチンによって認識されてゼノファジーを開始する管腔炭水化物部分のサイトゾルへの露出を引き起こします7、8。ゼノファジーは、細胞膜への細菌の脱出後だけでなく、宿主および病原体のタンパク質やリポ多糖のユビキチン化によっても開始されます。 LAP では、オートファジータンパク質の Atg8 ファミリーのメンバーが単一のファゴソーム膜に直接結合され、ファゴソームの成熟が可能になります 4。病原体の LAP への標的化は異なる結果をもたらすことが示されています。場合によっては制限的ですが、他の場合には細菌の複製を促進します5。機構的には、LAP は Atg7、Atg3、Atg5-12-16L1 の LC3 脂質化機構、PI3K 複合体 (Beclin1、UVRAG、Rubicon、Vps34、Atg101)、および NADPH オキシダーゼによる活性酸素種 (ROS) の生成を必要とします。。 LAP は、Xenophagy に必須である ULK1 複合体や Atg14 のコンポーネントを必要としません 11。最近の進歩にもかかわらず、細胞内病原体感染時の標準（ゼノファジー）オートファジー応答と非標準（LAP）オートファジー応答の間の空間的および時間的制御は、ヒトマクロファージでは依然として十分に特徴付けられていません。

ゼノファジーと LAP が結核菌 (Mtb) 感染に対する宿主マクロファージの応答に役割を果たしているという証拠があります 2,12。一方、Mtb は、オートファジーを妨げるいくつかの細菌エフェクターを宿主細胞に送達します 13。さらに、Mtb はファゴソーム膜に損傷を与え、差異 1 (RD1) の領域内にコードされる ESX-1 タイプ 7 分泌システム (T7SS) 14、15、16 と細胞壁脂質フチオセロールジミコセロサートの協調作用を通じて宿主細胞質ゾルに侵入します。 (PDIM)17、18、19、20。 Mtb のオートファジーへのターゲティングと Mtb による回避は非常に動的であり、時間的に制御されます 13,21。 Mtb によるファゴソーム膜への損傷は、複雑な尿細管小胞オートファゴソーム構造 (LC3-TVS) を誘導します 22。 LC3-TVS の誘導後、Mtb はオートファゴソーム膜から分離し、ゼノファジーを回避して細胞質ゾルに逃げます 22。 Mtb の残りのファゴソーム亜集団は、ファゴソーム成熟経路を積極的に操作します 13。しかし、サイトゾルにアクセスする細菌の亜集団の場合、ゼノファジーへの標的化はおそらく成功し、その制限につながります。 Mtb は CpsA の分泌を通じてこの経路を妨害するため、LAP はマウスマクロファージにおける Mtb 野生型 (WT) の制限には寄与しません。 CpsA は NADPH オキシダーゼの作用をブロックし、ファゴソーム ROS と LAP の活性化を低下させます 12。

マウスのマクロファージでは、重要な選択的オートファジー遺伝子のノックアウト（KO）によるオートファジー経路の破壊により、Mtb の複製が増加します 12、23、24、25。しかし、いくつかのマウスオートファジータンパク質を in vivo で条件付き KO しても、Mtb 細菌量や感染後のマウス生存率は変化しませんでした 26。インビトロでオートファジー応答によってMtbが効率的に制限され得ることは明らかであるが、これらのインビボでの結果は、結核(TB)マウスモデルにおけるMtbの制御にはオートファジーが重要ではないという仮説につながり、これは潜在的にインビボでの効果的な破壊に起因する。 ; したがって、結核におけるオートファジーの役割は依然として不明である。

堅牢な遺伝子システムが欠如しているため、初代ヒトマクロファージにおけるオートファジーの役割を研究するために特定の遺伝子欠失アプローチを使用することはこれまで実現できませんでした。ノックダウンまたは条件付きKO戦略では宿主細胞内のすべてのオートファジープロセスが不完全に除去される可能性があるため、このようなアプローチは感染症におけるオートファジーの理解を向上させる可能性があります。この記事では、ヒトのMtbを殺す際のオートファジーの役割をより深く理解するために、ヒトマクロファージ細胞モデルを開発し、細菌の複製と細胞死におけるATG7とATG14の役割を調査しました。

ヒトマクロファージにおけるMtb感染に対するオートファジー応答の役割を調査し、親株の遺伝的背景の変化に関連する不一致を減らすために、我々はMtb H37Rvバックグラウンドで2つの遺伝子欠失変異体と同族の相補株を作製した。まず、ファゴソーム損傷とゼノファジーの誘導に関与するESX-1 T7SSの2つの基質であるEsxAとEsxB（Mtb ΔesxBA）の両方を欠く株を生成しました（図1a）28、29。 esxBA の欠失は、全細胞溶解物と培養濾液の両方における EsxA および EsxB タンパク質をウェスタンブロットでプローブすることによって確認されました (図 1b)。予想通り、EsxA も EsxB も、対照として使用した Mtb ΔesxBA または Mtb ΔRD1 の培養濾液にも全細胞溶解液にも検出されませんでした。 Mtb ΔesxBA 変異体は、Mtb H37Rv esxB と esxA の両方の発現を染色体の MS6 部位にある強力な Psmyc プロモーター 30 の制御下に置くことによって補完されました。相補されたEsxAおよびEsxBタンパク質の発現と分泌は、ウェスタンブロットによって検証されました（図1b）。次に、CpsAを欠く2番目の変異株（Mtb ΔcpsA）を生成しました。これは、マクロファージのLAPをブロックできないことが報告されています12（図1c）。 Mtb ΔcpsA 変異体は、MS6 部位の強力な hsp60 プロモーターの制御下に置かれた cpsA 遺伝子の染色体組み込みによって補完されました。 EsxAおよびEsxBの産生および分泌は、Mtb ΔcpsAおよびMtb ΔcpsA:cpsAでは影響を受けませんでした（図1d）。重要なことに、これらの株のインビトロ複製プロファイル（図1e、f）とPDIM産生は7H9液体培地で同様であり、細胞外複製が影響を受けないことを示しています（図1g）。次に、生成されたすべての組換え株を E2-Crimson 蛍光タンパク質をコードするベクターで形質転換し、iPSDM での複製プロファイルをハイコンテントイメージングと単一細胞解析でさらに分析しました。マクロファージによるMtbの取り込みは、esxA/esxBまたはcpsA欠失の影響を受けませんでした（図1h）。ただし、感染の96時間後にiPSDMではMtb ΔesxBAの複製が減少しました（図1i、j）。 Mtb ΔcpsA 変異体による iPSDM の感染後にも同様の減少が観察されました (図 1k、l)。 Mtb ΔesxBA と Mtb ΔcpsA の両方を機能的な esxBA 遺伝子または cpsA 遺伝子で補完すると、マクロファージ内で複製する能力が回復しました（図 1i-l）。

a、c、Mtb WTおよびそれぞれの欠失株におけるMtb esxBA-rv3874-75遺伝子座(a)およびcpsA-rv3484遺伝子座(c)。黒い半矢印はプライマーの位置を示します (CmR、クロラムフェニコール耐性、ZeoR、ゼオシン耐性、Prom.、groEL プロモーター)。 b、d、Mtb WT、ΔRD1、ΔesxBA、ΔesxBA：BA（n = 3）（b）またはMtb WT、ΔcpsAおよびΔcpsA：cpsA株（n = 1）からの全細胞溶解物および培養濾液からのEsxAおよびEsxBのウェスタンブロット) (d)。 Ag85 をローディングコントロールとして使用しました。 e、Mtb WT、ΔesxBAおよびΔesxBA:BAの増殖曲線。 f、Mtb WT、ΔcpsAおよびΔcpsA:cpsA株の増殖曲線。 g、Mtb WT、ΔcpsA、ΔcpsA:cpsA、ΔesxBAおよびΔesxBA:BA培養物からのPDIMの薄層クロマトグラフィー分析（n = 1）。精製PDIMおよびMtb ΔPDIMからの抽出物を対照として使用した。 h、感染後2時間の、単一細胞あたりのMtb WT、ΔesxBA、ΔesxBA:BA (上)およびMtb WT、ΔcpsA、ΔcpsA:cpsA (下)面積の定量分析。 3 つの独立した実験の代表的なデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は、平均値±平均値の標準誤差（sem）として示されます。一元配置分散分析に続いて、Šídák の多重比較検定が行われました。 NS、有意ではない。 i、Mtb WT、ΔesxBAおよびΔesxBA:BAに感染した生iPSDMの感染96時間後のスナップショット。核染色 (青) および Mtb-E2-クリムゾン (赤)。スケールバー、50 μm。 j、Mtb WT、ΔesxBAおよびΔesxBA:BAによる感染後のMtb複製の定量分析。細胞当たりのMtb面積を、感染後2時間と比較した変化倍数として計算した。 3 つの独立した実験の代表的なデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は、平均 ± 標準誤差一元配置分散分析とその後のシダックの多重比較検定として示されています。 ***P < 0.001; NS、有意ではない。 k、感染後96時間のMtb WT、ΔcpsAおよびΔcpsA:cpsAに感染した固定iPSDMの代表的な画像。核染色 (青) および Mtb-E2-クリムゾン (赤)。スケールバー、50 μm。１、ＭｔｂＷＴ、ΔｃｐｓＡおよびΔｃｐｓＡ：ｃｐｓＡによる感染後のＭｔｂ複製の定量分析。細胞当たりのMtb面積を、感染後2時間と比較した変化倍数として計算した。 3 つの独立した実験の代表的なデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均±標準誤差として示されています。一元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定 **P < 0.002; NS、有意ではない。

ソースデータ

次に、クラスター化された規則的に間隔をあけた短いパリンドロームリピート（CRISPR）-Cas9を使用して、人工多能性幹細胞（iPSC）のATG7またはATG14のいずれかをノックアウトし、Mtbに対する標準的および非標準的オートファジー応答を調査しました（拡張データ図1a、d）。。オートファジー応答がATG7およびATG14 KO iPSC（ATG7-/-およびATG14-/-と呼ばれる）で変化するかどうかをテストしました。 WT iPSC (ATG7+/+ および ATG14+/+ と呼ばれる) は、飢餓による標準的オートファジー誘導、バフィロマイシン A1 (BafA1) によるオートファゴソーム分解の遮断、またはモネンシン処理による非標準的オートファジーの誘導に応答して LC3B-II を蓄積しました 31。 KO iPSC には検出不可能なレベルの LC3B-II がありました (拡張データ図 1b、e)。さらに、ATG7 KO iPSC は、WT iPSC と比較した場合、すべての条件下で p62 の蓄積を示しました（拡張データ図 1b）。予想通り、ATG14 KO iPSCは、摂食条件であってもWT iPSCと比較してp62レベルの増加を示し、飢餓またはBafA1のいずれかに応答してLC3B-IIのレベルを変化させることができませんでした（拡張データ図1e）。対照的に、モネンシン処理は、WTおよびATG14 KO iPSCの両方でLC3B-IIレベルの増加と検出不可能なレベルのLC3B-Iを引き起こしました（拡張データ図1e）。次に、iPSDM への分化が ATG7 KO および ATG14 KO iPSC のオートファジー表現型に影響を与えるかどうかをテストしました。予想どおり、ATG7 KO iPSDM は欠陥のある LC3B プロセシングを示し、休止状態では p62 レベルが増加しました (拡張データ図 1c)。機能的には、ATG14 KO iPSDMは、飢餓またはBafA1処理後のLC3Bプロセシングに実質的な変化を示さなかった（拡張データ図1f）。モネンシンによる非標準的オートファジーの誘導により、WTおよびATG14 KO iPSDMの両方でLC3Bプロセシングが増加し、テストしたすべての条件下でp62のレベルはほとんど変化しませんでした（拡張データ図1f）。次に、マクロファージマーカーの表面発現についてフローサイトメトリーによって iPSDM クローンの特徴を調べました。 M-CSF 誘導分化後、前に示したように、すべての iPSDM で CD14 の減少と CD11b 表面発現レベルの増加が示されました 22,32 (拡張データ図 2)。分化すると、ATG7 および ATG14 KO iPSDM の CD163 および CD206 の表面発現は WT iPSDM と同様でしたが、CD169 のレベルは ATG7 および ATG14 KO iPSDM の両方で高かった (拡張データ図 2)。

次に、ATG7 KO iPSDM に E2-Crimson を発現する Mtb WT、ΔesxBA、または ΔcpsA を感染させ、単一細胞ハイコンテンツイメージングによって細菌の複製を分析しました。マクロファージあたりのMtbシグナルは、感染96時間後にWT iPSDMと比較した場合、ATG7 KO iPSDMでは約3倍増加しました（図2a、b）。これらの違いは、取り込み時の細胞あたりの細菌面積とすべての時点での感染細胞の割合が両方の遺伝的背景で同様であったため、ATG7 KO iPSDMにおける細菌の取り込みまたは播種の変化によるものではありませんでした（拡張データ図3a、b）。 Mtb ΔesxBA 変異体とΔcpsA 変異体の両方が ATG7 KO iPSDM で制限されていたため、細菌複製の増加は Mtb WT の感染中にのみ観察されました（図 2c-f）。予想通り、ATG7 KO iPSDM を Mtb WT、ΔesxBA、または ΔcpsA に感染させた後、LC3B プロセシングの誘導はありませんでした (拡張データ図 3c)。 ATG7 KO iPSDMにおけるp62のレベルは、WT iPSDMと比較してMtb WTおよびΔcpsAの方が高かったが、これはおそらく転写アップレギュレーションによるものである(拡張データ図3c)。感染2時間後にはp40 PhoxのMtb WTおよびΔcpsAへの動員に差が観察されなかったため、iPSDMにおけるMtb ΔcpsAの制限はNADPHオキシダーゼ局在化とは関連しなかった(拡張データ図4)。しかし、感染後48時間では、感染したiPSDMにおけるMtb WTと比較した場合、p40 PhoxとMtb ΔcpsAの会合レベルは高かった。解析中に、Mtb WTに感染したATG7 KO iPSDMでは、ヒト単球由来マクロファージ（MDM）におけるMtb複製に関連するプロセスである細胞死を示唆するハイコンテンツイメージングによって解析された細胞の総数が減少していることに気づきました。 )14. これをテストするために、細胞膜の完全性が損なわれた細胞を選択的に染色する NucGreen で感染細胞を染色しました 33。 ATG7 KO iPSDMの死細胞の割合は、Mtb WTの感染後に有意に高く、ATG7 KO細胞では、感染がマクロファージ細胞死に関連していることを示しています（図2g、h）。

a、c、e、96時間におけるMtb WT（a）、ΔesxBA（c）およびΔcpsA（e）に感染した生ATG7+/+およびATG7-/- iPSDMのスナップショット。核染色 (青) および Mtb-E2-クリムゾン (赤)。スケールバー、50 μm。 b、d、f、ATG7+/+またはATG7-/- iPSDMにMtb WT（b）、ΔesxBA（d）およびΔcpsA（f）を感染させた後のMtb複製の高含有量定量分析。細胞当たりのMtb面積を、感染後2時間と比較した変化倍数として計算した。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均±標準誤差として示されています。比較には対応のない両側 t 検定が使用されました **P < 0.002; NS、有意ではない。 g、非感染（CTRL）またはMtb WTで96時間感染させたATG7+/+およびATG7-/- iPSDMの青/緑（生/死）染色の代表画像。核染色 (青) と死んだ核染色 (緑)。スケールバー、50 μm。 h、各条件におけるNucGreen陽性細胞の割合の定量分析。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±標準誤差として示されています。一元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定 ***P < 0.001、*P < 0.033。 NS、有意ではない。

ソースデータ

Mtb 制限における ATG14 の寄与を理解するために、WT および ATG14 KO iPSDM を Mtb WT、ΔcpsA または ΔesxBA で最長 96 時間感染させ、ハイコンテンツイメージングによって細菌の複製を分析しました。 Mtb WTの複製は、96時間の時点でWT iPSDMと比較してATG14 KO iPSDMで大幅に増強されました（図3a、b）。 Mtb WT に感染した ATG7 KO iPSDM と同様に、ATG14 KO iPSDM のほとんどは Mtb WT 感染後に細胞死を起こし、固定細胞画像に基づく解析ができなくなりました。しかし、ATG7 KOマクロファージと比較した場合、ATG14を欠くiPSDMにおける複製および細胞死の表現型は、感染後96時間でより顕著でした(感染96時間後のATG7 KO細胞死の30%に対してATG14 KO細胞死の50%)。両方のパラメーターが両方の遺伝的背景で類似していたため、Mtb複製のこの増加は、摂取後の食作用または細胞あたりの細菌面積の違いとは関連していませんでした（拡張データ図5a、b）。 ATG7を欠くiPSDMとは対照的に、ATG14 KO iPSDMでは変異体Mtb ΔesxBAもより効率的に複製されました（図3c、d）。 Mtb ΔesxBA とは異なり、ΔcpsA 変異体は依然として ATG14 KO iPSDM に制限されていました（図 3e、f）。未感染細胞と感染細胞の両方で、ATG14 KO iPSDMはWT iPSDMと比較してより高いLC3B-IIレベルを示し、オートファジー流動の障害を示唆しました（拡張データ図5c）。ATG14 KO iPSDMのp62レベルも、すべての条件でWT iPSDMと比較して高かったこれは、LC3B-II による以前の観測を裏付けています (拡張データ図 5c)。 NucGreen 染色で測定したところ、Mtb WT 複製の増加は、ATG14 KO iPSDM における死細胞数の増加と関連しており、細菌複製の亢進がマクロファージ細胞死を引き起こすことを示しています。対照的に、細胞死表現型の増強は、Mtb ΔesxBA にもΔcpsA にも感染した ATG14 KO iPSDM では観察されませんでした（図 3g、h）。

a、c、e、96時間におけるMtb WT（a）、ΔesxBA（c）およびΔcpsA（e）に感染した生ATG14+/+およびATG14-/- iPSDMのスナップショット。核染色 (青) および Mtb-E2-クリムゾン (赤)。スケールバー、50 μm。 b、d、f、ATG14+/+またはATG14-/- iPSDMにMtb WT（b）、ΔesxBA（d）およびΔcpsA（f）を感染させた後のMtb複製のハイコンテンツ定量分析。細胞当たりのMtb面積を、感染後2時間と比較した変化倍数として計算した。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±標準誤差として表示されます。比較には対応のない両側 t 検定を使用しました **P < 0.002、*P < 0.033; NS、有意ではない。 g、非感染（CTRL）またはMtb WT、ΔesxBAおよびΔcpsAで96時間感染させた青/緑（生/死）染色ATG14+/+およびATG14-/- iPSDMの代表画像。核染色 (青) と死んだ核染色 (緑)。スケールバー、50 μm。 h、各条件におけるNucGreen陽性細胞の割合の定量分析。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は、平均±標準誤差として示されています。二元配置分散分析とその後のシダックの多重比較検定 ***P < 0.001、**P < 0.002。スケールバー、50 μm。

ソースデータ

ATG14 KO iPSDM が細菌負荷が高いために死滅しているのか、それとも細胞死を経た後に Mtb 複製がより許容的になったのかを定義するために、ヨウ化プロピジウム (PI) の存在下で Mtb WT に感染した iPSDM のハイコンテンツ生細胞イメージングを実行しました。）、細胞膜の完全性の喪失のプローブ14。感染後96時間で観察したもの（図3g、h）と同様に、ATG14を欠くPI陽性iPSDMの比率はWT iPSDMよりも6倍高かった（図4a〜dおよび補足ムービー1）。 ATG14 KO iPSDM での感染の 72 時間後、細胞死は指数関数的に増加しました。これは、高い細菌負荷と相関していました（図 4c、d および補足ムービー 1）。 ATG14 KO iPSDM では 48 時間以降、Mtb 複製がより高くなりましたが、細胞死の増加は 72 時間以降のみ観察され、Mtb 複製の亢進が細胞死に先行することが示唆されました。我々は、細菌負荷の高いATG14欠損マクロファージの大部分が細胞膜の完全性を失い、PI陽性になることを観察した。細胞が漏れやすくなった後も細菌の複製は続き、細菌量が増加した細胞のほとんどは損傷を受けました。細菌複製の定量分析により、WT と ATG14 KO iPSDM の間の顕著な違いが捕捉されました。細菌複製の変化倍数は、WT iPSDMの4倍と比較して、ATG14 KO iPSDMでは8倍でした（図4a、c）。これは、生存率染色ステップ中に重度に感染した細胞が失われるため、ライブスナップショットアプローチでは倍率変化が過小評価されていることを示しました。我々の発見を検証するために、ヌクレオフェクション34により、Cas9タンパク質とシングルガイドRNA（sgRNA）からなるリボ核タンパク質（RNP）複合体としてCRISPR – Cas9を使用し、ヒトMDMのATG7とATG14を標的にしました34（図4e、f）。 MDMの感染後、ATG14を欠くMDM（図4g）では、WT（図4h）またはATG7欠損MDM（図4）よりも、Mtb WT（2.6倍）とΔesxBA（0.3倍）の両方で高い複製率がありました。 .4i）。 MDMにおけるATG7のプールKOは、WT MDM（0.6倍）と比較した場合、感染5日後にMtb WT複製の増加（1.1倍）を示しました（図4g、i）。ただし、この増加は Mtb ΔesxBA では観察されませんでした。

a、c、ATG14+/+ (a) または ATG14-/- (c) iPSDM における生きた Mtb WT 複製のハイコンテンツ定量分析。 Mtb 面積 (点プロット) および細胞死 (棒プロット) を、感染後 0 時間の時点での Mtb 取り込みに対する倍率変化として計算しました。 2 つの独立した実験のうちの 1 つから得られたデータを表します。 b、d、ATG14+/+（b）またはATG14-/-（d）PI（赤）の存在下でMtb WT（緑）に感染させたiPSDMの示された時点での代表的な顕微鏡写真。 2 つの独立した実験のうちの 1 つから得られたデータを表します。スケールバー、50 μm。 e、f、ATG14 (e) または ATG7 (f) のヒト MDM プール KO のウェスタンブロット。 2 つの独立した実験のうちの 1 つから得られたデータを表します。 g、ヒトMDMにおける生きたMtb WTおよびΔesxBA複製の高含有量定量分析。 Mtb 面積 (ドットプロット) を、感染後 0 時間の時点での Mtb 取り込みに対する変化倍数として計算しました。 h、i、ATG14（h）またはATG7（i）のヌクレオフェクトヒトMDMプールKOにおける生きたMtb WTおよびMtb ΔesxBA複製のハイコンテンツ定量分析。 Mtb 面積 (ドットプロット) を、感染後 0 時間の時点での Mtb 取り込みに対する変化倍数として計算しました。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ。

ソースデータ

次に、Mtb WTの複製の増加が細胞質へのアクセスの強化によるものであるかどうかを理解することに焦点を当てました。これをテストするために、損傷したファゴソーム膜の内腔グリカンを認識することが知られているガレクチン 3 (Gal3) をマーカーとして使用しました。 ATG7 KO iPSDMにおけるGal3に関連するMtb WTの割合は、WT iPSDMと異ならなかった（拡張データ図6a、b）。 Mtb WTおよびΔcpsAに対するGal3の明らかな関連は、WTおよびATG7 KO iPSDMの両方で観察されましたが、Mtb ΔesxBAではほとんど存在しませんでした（拡張データ図6a、b）。 Mtb WT および ΔcpsA を含む Gal3 陽性ファゴソームの割合は、WT iPSDM と比較して、ATG14 欠損 iPSDM では感染後 2 時間で高かった（図 5a、b）。この効果は感染の初期段階で観察され、ATG14 が細胞質ゾルへの Mtb の早期アクセスを調節していることを示唆しています。予想通り、Gal3 陽性 Mtb ΔesxBA のレベルは WT と ATG14 KO iPSDM の両方で低く、感染後の後の時間では ΔcpsA について iPSDM 遺伝子型間に差はありませんでした（図 5a、b）。次に、Mtb による膜損傷の結果である LC3-TVS の生成を分析しました 22。 Gal3関連の結果と一致して、LC3-TVS陽性Mtb WTの割合はATG14 KO iPSDMで有意に高く、損傷したMtbファゴソームの割合がより高いことを示唆しています（図5c）。予想通り、この効果はMtb ΔcpsA変異体でも観察されましたが、Mtb ΔesxBA感染細胞では観察されず、ESX-1分泌系の役割が確認されました（図5c）。これらの細胞では、MtbへのLC3Bの動員に差はありませんでした（図5d）。これらの観察を超微細構造レベルで確認するために、透過型電子顕微鏡 (TEM) によって細菌の局在を分析しました。サイトゾル細菌の立体学的分析により、感染後48時間でMtb WTのより高い割合がATG14欠損iPSDMのサイトゾルに局在していることがさらに確認されました（図5e）。 WT および ATG14 KO マクロファージでは、ΔesxBA の大部分がファゴソームに局在していました。ただし、WT 細胞とは異なり、ATG14 iPSDM では、ΔesxBA のごく一部がサイトゾルにありました。これはおそらく、高レベルの細菌とファゴソーム膜損傷における報告されている PDIM の効果の組み合わせによるものと考えられます 17、18、35、36。

a、Mtb WT、ΔesxBA、またはΔcpsAに感染したATG14+/+またはATG14-/- iPSDMにおけるGAL3染色。核染色 (青)、GAL3 (緑)、および Mtb E2-Crimson (赤)。スケールバー、10 μm。 b. 3 つの独立した実験から収集されたデータ。結果は平均値±標準誤差として示されています。一元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定 ***P < 0.001、**P < 0.002; NS、有意ではない。 c、d、Mtb WT、ΔesxBAまたはΔcpsAに感染させたATG14+/+またはATG14-/- iPSDMのLC3B染色（上）および定量（下）、感染後2時間。 TVS-LC3B 陽性コンパートメント (c) または LC3B 陽性コンパートメント (d) の Mtb。核染色 (青)、LC3B (緑)、および Mtb E2-Crimson (赤)。スケールバー、10 μm。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 5 つの独立したフィールド)。結果は平均値±標準誤差として示されています。一元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定 ***P < 0.001、**P < 0.002; NS、有意ではない。 e、感染48時間後のATG14+/+またはATG14-/- iPSDMの異なる細胞内位置におけるMtb WTまたはΔesxBAの透過型電子顕微鏡写真（左）およびTEM画像からのMtb WTおよびΔesxBAの細胞内分布の立体定量化（右）。 2 つの独立した実験から収集されたデータ。スケールバー、500 nm。

ソースデータ

以前の結果は、MTb WT に対する ATG14 KO iPSDM の非常に許容的な挙動の説明を提供しました。しかし、サイトゾルに効率的にアクセスできないMtb ΔesxBAの複製速度が高いことは予想外でした。さらに、TEM の結果は、Mtb ΔesxBA の複製にとって許容的なファゴソーム内環境を示唆しました。これをさらに調査するために、感染中に酸性オルガネラプローブLysoTracker（LTR）に関連するMtbを分析し、ファゴソーム成熟の尺度としてLTRの平均強度を定量しました。感染の2時間後、ATG14 KO感染iPSDMでは、MTb WTとΔesxBAの両方でLTRの平均強度が低くなりました（図6a、b）。 LTR関連性は、感染の24時間後でも、ATG14 KO iPSDMにおけるMtb WTおよびΔesxBAについては低いままでした（図6a、b）。 ATG7 KO iPSDMにおける複製結果と一致して、WTとATG7 KO iPSDMでは、Mtb WTまたはΔesxBAに関連するLTR強度に有意な差は観察されませんでした（拡張データ図6c、d）。 Mtb ΔesxBA が主にファゴソーム内に存在することを考えると、これらの結果は、ATG14 が Mtb ファゴソームの成熟に必要であることを示唆しました。これらの観察を確認するために、環境の pH と塩素濃度に応答するデュアルレポーター株 (rv2390::mWasabi、pMSP12::E2Crimson) を生成しました 37。このレポーターには、ファゴソーム成熟の指標であるファゴソーム内の塩化物 [Cl-] 濃度の増加と pH の低下に応答して、E2-Crimson の発現を駆動する構成的プロモーター pMSP12 と mWasabi の発現を駆動する rv2390 のプロモーターが含まれています 37。感染したiPSDMでmWasabi/E2-Crimsonの比を分析したところ、マウスマクロファージで以前に報告されているように、pHと塩化物に応答するプロモーターの活性が最大48時間まで大幅に増加することがわかりました（図6c、d）。対照的に、ATG14 KO iPSDMでは、感染の48時間後でもプロモーターの活性は低いままでした（図6c、d）。バフィロマイシンA1（BAF）によるMtbファゴソームのV-ATPアーゼ依存性酸性化の阻害により、WTおよびATG14 KO iPSDMの両方でrv2390プロモーターの活性が損なわれました（図6c、d）。

a、LTRおよびNucBlue色素で染色した、Mtb WTおよびΔesxBAに感染させた生ATG14+/+またはATG14-/- iPSDMのスナップショット。核染色 (青)、LTR (緑)、および Mtb E2-Crimson (赤)。スケールバー、10 μm。 b、平均蛍光強度（MFI）としてのMtbとのLTR関連の定量分析。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は、平均±標準誤差の一元配置分散分析と、その後のシダックの多重比較検定として示されています***P < 0.001、**P < 0.002、*P < 0.033。 c、BafA1 (BAF)の存在下または非存在下でrv2390::mWasabi,pMSP12::E2-Crimsonレポーターを発現するMtbに感染したATG14+/+またはATG14-/- iPSDMのスナップショット。スケールバー。 10μm。 d、ATG14+/+またはATG14-/- iPSDMによる感染の示された時点での、E2-Crimsonに対するmWasabiのMFIとしてのrv2390プロモーター活性の定量分析。 3 つの独立した実験のうちの 1 つから得られたデータを表します (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±標準誤差として示されています。一元配置分散分析とそれに続くシダックの多重比較検定 ***P < 0.001、**P < 0.002; NS、有意ではない。 e、感染48時間におけるrv2390::mWasabi、pMSP12::E2-Crimsonレポーターを発現するMtb WT、ΔesxBAまたはΔcpsA株に感染させたATG14+/+またはATG14-/- iPSDMのスナップショット。スケールバー、10 μm。 f、ATG14+/+またはATG14-/- iPSDMによる感染の示された時点でのMtb WT、ΔesxBAまたはΔcpsA株におけるE2-Crimsonに対するmWasabiのMFIとしてのrv2390プロモーター活性の定量分析。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は、平均 ± 標準誤差として示されています。二元配置分散分析と、その後のシダックの多重比較検定です。 ***P < 0.001; NS、有意ではない。

ソースデータ

次に、同じレポーターで Mtb ΔesxBA 株と ΔcpsA 株を形質転換し、iPSDM に感染させました。 WT iPSDMの感染後、Mtb ΔesxBAのプロモーター活性はMtb WTよりも有意に高かった（図6e、f）。対照的に、Mtb ΔesxBA rv2390::mWasabi レポーター活性は、ATG14 KO iPSDM では大幅に減少しました（図 6e、f）。 Mtb WTと同様に、Mtb ΔesxBAと比較した場合、Mtb WTとΔcpsAの両方が低pHおよび[Cl-]への曝露が少なかったため、Mtb ΔcpsAのrv2390::mWasabiレポーター活性もATG14 KO iPSDMで減少しました（図6e、f））。 BAF処理により、試験したすべての条件でrv2390::mWasabiレポーター活性が減少し、レポーターの活性がpH依存性であることが確認されました（拡張データ図6e、f）。

私たちは、遺伝的アプローチとイメージングアプローチを組み合わせて、オートファジー欠損ヒトマクロファージがMtb制御に重大な欠陥を持っていることを示しました。私たちのヒトマクロファージモデルは、Mtb感染時のオートファジーの機能を調べるツールを提供します。遺伝子欠失アプローチによるオートファジー経路の破壊は、マウスマクロファージにおける in vitro での Mtb 複製を大幅に増加させることが報告されており 23、24、25、この論文で提示されたデータは、少なくとも ATG7 と ATG14 については、これも同様であるという遺伝的証拠を提供します。ヒトのマクロファージの場合。

マウスモデルで研究された6つのAtgタンパク質のうち、コロニー形成単位、炎症、および生存によって測定されるように、生体内でのWT Mtb感染に実質的な影響を与えるのはAtg5だけです26,38。しかし、観察された in vivo の病理は主に、説明されていないメカニズムによる好中球性炎症の増加と Atg5 のオートファジー非依存性機能によるものです 26,38。これまでのところ、これらの矛盾した結果を説明する議論の 1 つは、in vitro では複製の差が大きくないため、in vivo 環境に直接反映されないということです。組織内の多数の細菌がヒトTB39に関連しているかどうかは不明ですが、ATG7およびATG14オートファジー遺伝子を欠くヒトマクロファージを用いた実験では、細胞がMtbに対して非常に許容性が高く、広範囲の壊死細胞と関連していることが観察されました。死。マウスのマクロファージは、生体内での結核の制御に不可欠な高レベルの一酸化窒素 (NO) を肺で生成します40。高レベルの NO はオートファジー依存性の影響の一部を隠す可能性があります。さらに、条件付き KO のためにマウスで使用される Cre-lox 組換えシステムは 100% 効率的ではなく、いくらかの残留オートファジーが存在する可能性があります 41。重要なのは、さまざまな状況においてオートファジーと細胞死の間には微妙なバランスがあり、特定の細胞型における重要なオートファジー遺伝子の in vivo での条件的欠失は、in vivo でのこれらの細胞の生存に影響を与え、特に細胞集団を枯渇させる可能性があることです。これまで、オートファジーの研究に使用された in vivo モデルは結核に耐性のある C57BL/6 マウスであったが、C3H/HeBFeJ42 マウスや B6.Sst1S マウスなどの結核感受性マウス系統におけるオートファジーの役割を調査することが重要であると考えられる43。壊死性病変はヒト結核によく似ています。

我々のデータは、ATG7 および ATG14 依存性の細胞死の制限と誘導が主に Mtb WT 感染に関連していることを示しています。私たちのデータは、ATG7 と ATG14 の両方が、サイトゾルからの細菌の再捕捉 22 またはサルモネラ菌について報告されているオートファゴソームによる損傷したファゴソームの封鎖を通じて、サイトゾル細菌の複製を制御しているという概念を裏付けています 44。 Mtb ΔcpsA 変異体はファゴソーム膜に損傷を与えることができますが、感染の初期段階で弱毒化が起こったり、栄養素の獲得などにおける未知の欠陥により、Mtb ΔcpsA 変異体がサイトゾル内で効率的に複製できない可能性があります。。

我々の遺伝的KO実験は、ヒトマクロファージにおける変異型Mtb ΔcpsAの制御には標準オートファジーも非標準オートファジーも必要ないことを示唆している。 Atg7 KO マウスマクロファージは、感染後 72 時間までは Mtb ΔcpsA を制限できませんでした 12。しかし、iPSDMでは、Mtb ΔcpsAは、標準オートファジーと非標準オートファジーの両方が欠損しているATG7 KOマクロファージと、標準オートファジーではあるが非標準オートファジーが損なわれているATG14 KOマクロファージの両方で複製の減弱を示しました。マウスマクロファージでは、Mtb CpsA KO 変異体の弱毒化は、LAP を引き起こす NADPH オキシダーゼ動員とファゴソーム ROS 産生の増加によるものであることが示されています。初代マウスマクロファージにおける結果とは異なり、iPSDM では、Mtb ΔcpsA は感染後 2 時間で Mtb WT と同様のレベルで NADPH オキシダーゼを動員しました。この不一致は、マウスとヒトのマクロファージ、分化プロトコル、および使用した Mtb 親株の遺伝的背景の違いによるものである可能性があります。この研究で使用された株はすべて同じ親株に由来しており、PDIM 状態についてテストされているため、感染時の表現型の結果を直接比較することができます。これに関連して、Mtb ΔcpsA 変異体がヒトマクロファージ内で制限される正確な機構を定義するには、さらなる研究とその局在の特徴付けが必要です。

我々は、ATG7とATG14がヒトマクロファージにおけるMtbの細胞内ライフスタイルの異なる段階で作用すると提案する。 ATG7 KO マクロファージは、Mtb WT の複製と Mtb 誘導細胞死において有意な変化を示しましたが、標準的なオートファジーのみを破壊し、非標準的なオートファジーを無傷のまま残す ATG14 の KO は、Mtb WT と変異体の複製のより顕著な増加をもたらしました。 MtbΔesxBA。 ATG14 がオートファゴソームとリソソーム間の融合を調節し 45、オートファジーに依存しないエンドソーム経路での機能も持っているという証拠があります 46。われわれは、ATG14がマクロファージにおけるMtb含有ファゴソームとリソソーム間の融合も調節していることを発見したが、このプロセスを調節する機構についてはさらに研究する必要がある。私たちの結果は、Dyctiostelium21 で示されているように、ファゴソームの成熟と細胞質へのアクセスとの間の関連の可能性について疑問を引き起こします。ファゴソーム成熟の低下は膜損傷の増加の結果ですか? それとも、ファゴソーム成熟の低下により膜損傷が増大し、細胞質へのアクセスが増加するのでしょうか? さらなる研究は、これらの出来事がどのように一時的に制御されるかを明らかにするでしょう。

まとめると、我々のデータは、ATG7とATG14がマクロファージによるMtb感染の制御に必要であることを明らかにし、オートファジータンパク質がさまざまな段階を制御していることを示している：ATG7とATG14は、Mtbファゴソームとリソソームの融合に加えて、サイトゾルMtbとATG14の制御を制御している。オートファジーがヒトの細胞内病原体の感染を制御するためにどのように作用するかを理解することで、宿主指向性療法の開発が可能になります。

Mtb H37Rv (Mtb WT) は、Douglas Young 教授 (フランシスクリック研究所、英国) によって提供されました。 cpsA (rv3484) または esxB および esxA (rv3874 および rv3875) の Mtb 欠失変異体は、ORBIT47 を使用して構築されました。各変異体について、形質転換体は PCR (補足表 1) によって検証され、全ゲノム配列決定によって確認されました。 cpsA 遺伝子欠失の補完は、染色体の MS6 部位からの hsp60 プロモーターの制御下での Mtb H37Rv cpsA 遺伝子の発現によって実行されました。 esxBA 遺伝子欠失の相補は、Mtb H37Rv esxB と esxA の両方の発現を染色体の MS6 部位からの Psmyc プロモーター 30 の制御下に置くことによって達成されました。蛍光株は、pTEC19 (Addgene #30178、Lalita Ramakrishnan 教授由来) から E2-Crimson を発現するように操作されました。 Mtb のデュアルレポーター株は、pTEC19 と同じ構成プロモーターからの E2-Crimson のエピソーム発現によって構築され、pTEC15 ベクター (Addgene #30174、Lalita Ramakrishnan 教授由来) から増幅された mWasabi 遺伝子は塩化物の制御下に置かれました。 - および低 pH 応答性の rv2390c プロモーター 37,48。 Mtb 株を、0.2% グリセロール (Fisher Chemical、G/0650/17)、0.05% Tween-80 (Sigma-Aldrich、P1754) および 10% ADC (BD Biosciences、 212352）。必要に応じて、適切な選択マーカー 50 μg ml-1 ハイグロマイシン (Invitrogen、10687010)、25 μg ml-1 カナマイシン (Sigma-Aldrich、K1876) または 25 μg ml-1 ゼオシン (Invivogen、ant-zn-05) を使用しました。

30 ミリリットルの対数期マイコバクテリア培養物を室温、2,000 g で 5 分間遠心分離しました。上清を除去し、0.22 μm フィルターで 2 回濾過しました。ペレットを洗浄緩衝液 (PBS-Tween-80 0.05% または PBS-Tyloxapol 0.05%) で洗浄し、次に PBS で洗浄しました。ペレットをプロテアーゼ阻害剤を含む５００μｌのＰＢＳに再懸濁し、ガラスビーズ（Ｓｉｇｍａ、Ｇ－１１４５）を１／３満たした２ｍｌのスクリューキャップチューブに移した。サンプルを設定 6.5 で 30 秒間リボライシスし、氷上に 5 分間置き、4,000g、4 °C で 1 分間遠心分離を 2 回行いました。残った上清を4℃、4,000gで10分間遠心分離し、500μlをMillipore Ultrafree-MC遠心フィルターデバイスに移した。サンプルは、Millipore Ultrafree-MC 遠心フィルターデバイスを使用して、4,000g、5 分間、4 °C で 2 回濾過されました。

EIKA2 および KOLF2 ヒト iPSC は、Public Health England Culture Collections (それぞれカタログ番号 77650059 および 77650100) から入手し、Essential 8 培地 (Gibco、A1517001) を含むビトロネクチン XF (StemCell Technologies、100–0763) でコーティングされたプレートで維持されました。細胞はSTRプロファイリングによって認証され、マイコプラズマ汚染がないか毎月チェックされました。細胞は、Versene (Gibco、15040066) を使用して継代されました。単球工場は、以前に報告されたプロトコルに従ってセットアップされました32。胚体（EB）には、50 ng ml-1 hBMP4（Peprotech、120-05）、50 ng ml-1 hVEGF（Peprotech、100-20）および 20 ng ml-1 を補充した E8 による 50% 培地交換を 2 回行い、毎日栄養を与えました。 -1 hSCF (Peprotech、300-07) を 3 日間投与。 4日目にEBを収集し、XVIVOファクトリー培地またはOXMファクトリー培地にT175フラスコあたり100〜150EBまたはT225フラスコあたり250〜300EBを播種しました（補足表2）。これらの単球工場には、上清中に単球が観察されるまで 5 週間毎週給餌されました。上清の最大 50% を毎週収集し、300 g で 5 分間遠心分離しました。細胞を XVIVO 分化培地または OXM 分化培地に再懸濁しました (補足表 2)。単球を 10 cm ペトリ皿あたり 4 × 106 細胞でプレーティングし、7 日間かけて分化させました。 4日目に50%の培地交換を実施した。剥がすために、細胞を PBS (pH 7.4) で 1 回洗浄し、Versene とともに 37 °C、5% CO2 で 15 分間インキュベートした後、PBS で 1:3 に希釈し、穏やかにこすり落としました。マクロファージを 300g で遠心分離し、実験のためにプレーティングしました。

10 ミリリットルの対数培養物を 1 ml の PBS 中で 95 °C で 2 時間不活化しました。水中で３回洗浄した後、クロロホルム：メタノール（２：１）およびメタノール：クロロホルム（１：１）中での連続インキュベーションからの上清をプールし、５５℃で乾燥させた。乾燥脂質をさらにクロロホルムに再懸濁し、石油エーテル:酢酸エチル (98:2) 溶媒混合物を使用してシリカゲルプレート上で分離し、精製 PDIM (H37Rv、精製フチオセロールジマイコセロサート、BEI Resources、 NR-20328) と PDIM 合成に欠陥のある株 49 を、それぞれポジティブコントロールとネガティブコントロールとして使用しました。

CRISPR-Cas9 ベースの KO 戦略では、特定の遺伝子エクソンに隣接する 4 つの sgRNA を使用して、ゲノム配列の欠失を取得しました。 ATG7 および ATG14 を標的とする sgRNA は、WGE CRISPR 設計ツール (www.sanger.ac.uk/htgt/wge/)50 を使用して設計および選択されました。 Amaxa 4D-Nucleofector (V4XP-3024、Lonza) を使用して EIKA2 iPSC のヌクレオフェクションを実行し、ATG7 KO クローンを取得しました。 ATG7 KO iPSC は生存可能であり、EB 形成および単球生成ステップは変動しましたが、複製欠損は示されませんでした。各ヌクレオフェクションでは、1 × 106 個のヒト iPSC を、合計 16 個の Sp Cas9 (Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3、1081059、IDT) と混合した 20 μg の Sp Cas9 (Alt-R Sp Cas9 Nuclease V3、1081059、IDT) を含む 100 μl の P3 バッファー (Lonza、V4XP-3024) に再懸濁しました。 μgの合成化学修飾シングルガイドRNA（Synthego）（補足表3）。次に、細胞と Cas9-RNP 混合物をプログラム CA-137 でヌクレオフェクトしました。ヌクレオフェクション後、単一クローンを手動で選択し 51、PCR ベースのアッセイによってスクリーニングしました (配列については、補足表 1 を参照)。 ATG14 KOおよびATG7 KOクローンを取得するためのKOLF2 iPSCのヌクレオフェクションを上記のように実施した。

細胞を収集し、PBS/0.1% BSA (Cell Signaling Technologies、9998S) および細胞 100 万個あたり 5 μl の Fc ブロック中で 20 分間インキュベートしました。５０マイクロリットルの細胞を、ＰＢＳ／０．１％ＢＳＡで希釈した５０μｌの抗体カクテルとともに、暗所の氷上で２０分間インキュベートした。細胞を２ｍｌのＰＢＳで洗浄し、２％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ；電子顕微鏡科学、１５７１０）で固定した。細胞はLSRIIフローサイトメーターで分析されました。抗体はBD Biosciencesから購入し、補足表4に詳細に示します。フローサイトメトリーデータを分析し、FlowJo (BD Biosciences)でプロットしました。

iPSDM は、96 ウェルプレートのウェルあたり 50,000 細胞、24 ウェルプレートのウェルあたり 150,000 細胞、12 ウェルプレートのウェルあたり 500,000 細胞、および 6 ウェルプレートのウェルあたり 1 × 106 細胞の密度で播種されました。井戸プレート。対数期中期の細菌培養物 (OD600 0.5 ～ 1.0) を 2,000 g で 5 分間遠心分離し、PBS で 2 回洗浄しました。次に、ペレットを 2.5 ～ 3.5 mm ガラスビーズ (VWR、332124 G) とともに 1 分間激しく振盪し、細菌を 10 ml マクロファージ培地に再懸濁した後、300 g で 5 分間遠心分離して大きな塊を除去しました。細菌懸濁液の上部 7 ml を採取し、OD600 を記録し、懸濁液を感染用に適切に希釈しました。取り込みの 2 時間後、細胞外細菌を PBS で 2 回洗浄して除去し、マクロファージを 37 °C、5% CO2 でインキュベートしました。感染後の必要な時点で、細胞を収集するか、4% PFA で固定しました。 OD600 1 が 1 × 108 細菌 ml-1 であると仮定して、目標感染多重度 (MOI) 1 をすべての実験に使用しました。バフィロマイシン A1 処理は、感染と並行して最終濃度 100 nM で行い、最後の時点まで存在させ続けました。

細胞は、NHS 血液移植サービスによって供給された白血球錐体 (NC24) から調製されました 14。白血球は、Ficoll-Paque Premium (GE Healthcare、17-5442-03) で 300g で 60 分間遠心分離することによって単離されました。単核球を収集し、MACS 洗浄液 (Miltenyi、130-091-222) で 2 回洗浄して、血小板と赤血球を除去しました。残りのサンプルを、ペレット当たり10mlのRBC溶解緩衝液(Sigma、R7757)とともに室温で10分間インキュベートした。細胞をリンスバッファーで洗浄し、1% BSA (Miltenyi、130-091-376) (MACS/BSA) および 20 µl の抗 CD14 磁気ビーズ (Miltenyi、130-050-201) を添加した 80 µl MACS リンス溶液に再懸濁しました。 ) 108 セルあたり。氷上で 20 分後、細胞を MACS/BSA 溶液で洗浄し、MACS/BSA 溶液 500 μl あたり 108 細胞の濃度で再懸濁し、さらにフィールド内の LS カラム (Miltenyi、130-042-401) に通しました。 QuadroMACS セパレータマグネット (Miltenyi、130-090-976)。 LS カラムを MACS/BSA 溶液で 3 回洗浄し、CD14 陽性細胞を溶出、遠心分離し、GlutaMAX および HEPES (Gibco、72400-02) および 10% ウシ胎児血清 (FBS; Sigma、 F7524）。

細胞をPBSで2回洗浄し、Lonza 2b Nucleofector (Nucleofector 2b Device、AAB-1001) を使用して、適切な一次ヌクレオフェクション溶液(Amaxa Human Monocyte Nucleofector Kit、カタログ番号 VPA-1007)中でエレクトロポレーションを行いました。反応ごとに合計 5 × 106 個の細胞を使用し、合計 12 μg のターゲティング合成化学修飾シングルガイド RNA (Synthego) と混合した 4 μg の Sp Cas9 (IDT) を含む 100 μl の一次ヌクレオフェクション溶液に再懸濁しました。表3)。次に、Y001 プログラムを使用して、MDM に sgRNA プールと Cas9-RNP 混合物をヌクレオフェクトしました。ヌクレオフェクトされた細胞は、6 ウェルプレート内の GlutaMAX、HEPES、および 10% FBS を補充した予熱した RPMI 1640 中で培養されました。ヌクレオフェクションの２時間後、１００ｎｇｍｌ−１ｈＭ−ＣＳＦを細胞に添加した。ディッシュは、5% CO2 の加湿された 37 °C インキュベーター内でインキュベートされました。 3日後、100ng ml-1hM-CSFを含む等量の新鮮な完全培地を添加した。 6日後、分化したマクロファージを、セルスクレーパー(Sarsted、83.1830)を使用して氷冷PBS中の0.5 mM EDTA中で剥離し、遠心分離によってペレット化し、10% FBS34を含むRPMI培地に再懸濁した。

細胞を PBS で 1 回洗浄し、EDTA を含まない完全プロテアーゼ阻害剤 (Thermo Fisher Scientific、78445) を含む RIPA バッファー (Millipore、20-188) 中で氷上で溶解し、LDS サンプル中で 95 ～ 100 °C で 20 分間煮沸しました ( Thermo Fisher Scientific、NP008) および NuPage サンプル削減剤 (Thermo Fisher Scientific、NP009)。サンプルを 4 ～ 12% Bis-Tris ゲル (Thermo Fisher Scientific、WG1403BOX) にロードし、100 V で 120 分間電気泳動を実行しました。プログラム P0 を使用して iBlot2 (Thermo Fisher Scientific、IB21001) を使用してゲルを PVDF 膜に転写しました。メンブレンを、TBS に 0.05% Tween20 を加えた 5% 脱脂粉乳 (TBS-T) 中で室温で 1 時間ブロックし、一次抗体とともに 4 °C で一晩インキュベートしました。膜をTBS-Tで洗浄し、西洋ワサビペルオキシダーゼ（HRP）結合二次抗体とともに室温で1時間インキュベートしました。膜は強化化学発光試薬 (Bio-Rad) で現像し、Amersham GE Imager 680 (GE Healthcare) で画像化しました。分子量ラダーはAbcam (116028) から入手しました。

細胞を PBS で 2 回洗浄し、100 nM バフィロマイシン A1 (Merck、B1793-10UG) または 50 μM を含むまたは含まないハンクス平衡塩類溶液 (Thermo Fisher Scientific、14170088) を含む完全培地またはアミノ酸を欠乏させた培地で 2 時間インキュベートしました。モネンシン（シグマアルドリッチ、M5273-5G）。使用した抗体は、Cell Signaling Technologies の p62 (5114)、Atg7 (8558)、Atg14 (5504 S)、β-actin-HRP (12262)、LC3B (ab48394)、anti-ESAT6 (EsxA、ab26246)、anti-CFP10 ( EsxB、ab45074) および抗 Ag85 (ab36731) (Abcam 製)、HRP 結合抗ウサギ IgG (W4011) および HRP 結合抗マウス IgG (W4021) は Promega 製です。

細胞を4% PFA/PBSで固定し、50 mM NH4Cl/PBSで室温で10分間クエンチし、0.3% Triton X-100、5% FBS/PBSで30分間透過処理した。抗体を5% FBSを含むPBSで希釈し、室温で1時間インキュベートしました。抗体間では、細胞を PBS で 3 回洗浄しました。核を、ＰＢＳで１：１０，０００に希釈したＤＡＰＩ（ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ、Ｄ１３０６）で１０分間染色した。カバーガラスをDAKO封入剤(DAKO、S3023)を用いてスライドガラスに封入した。使用した抗体は、Alexa Fluor 488 抗マウス/ヒト Mac-2 (Galectin-3) 抗体 (BioLegend、125410、1:500)、抗 LC3B (MBL、PM036、1:100)、p40 Phox (Millipore、07-) でした。 503、1:100）および抗ウサギ Alexa Fluor 488（Life Technologies、A11034、1:500）。

カバースリップは、63×1.4 開口数 (NA) 油浸対物レンズを備えた Leica SP8 倒立共焦点顕微鏡 (Leica Microsystems) を使用して画像化されました。蛍光は、HyD 検出器を使用して検出されました。レーザーと検出器の設定は、実験の各生物学的複製の条件間で一定に保たれました。

感染の 72 時間または 96 時間後、メーカーの推奨に従って、Blue/Green ReadyProbes Cell Viability Imaging Kit (Invitrogen、R37609) を使用して細胞を 30 分間染色しました。感染後 2、24、および 48 時間の時点の画像化には、NucBlue ReadyProbes 試薬 (Thermo Fisher Scientific、R37605) のみを使用しました。生細胞イメージングは、40×1.1 NAの水浸対物レンズを備えたOPERA Phenix顕微鏡（Perkin Elmer）を使用し、隣接するフィールド間のオーバーラップが10％で、実験ごとに条件ごとに3つのウェルを使用して実行されました。セグメンテーションと分析は、Harmony ソフトウェア (Perkin Elmer、バージョン 4.9) を使用して実行されました。ここでは、約 1 μm の距離で個々の Z 平面の最大投影を使用して、「核の検索」と「細胞の検索」を組み合わせて単一細胞のセグメンテーションを実行しました。ビルディングブロック。 Mtb 複製を定量化するために、Harmony の「Find Spots」構成要素によって細菌が検出されました。各細胞の細菌面積を決定するために、セグメント化された各細胞のスポット面積を合計しました。各時点および条件の細胞あたりの平均細菌面積を R Studio (統計コンピューティングのための R プロジェクト、バージョン 1.3.1073) にインポートしました。次に、結果が .csv ファイルとしてエクスポートされました。倍率変化としてのMtb増殖は、次の式によって計算されました:(時点の細胞あたりの平均Mtb面積 - t2hにおける細胞あたりの平均Mtb面積)/(t2hにおける細胞あたりの平均Mtb面積)。

細胞死を評価するために、Harmony ソフトウェアを使用してセグメンテーションと分析を実行しました。ここでは、約 1 μm の距離で個々の Z 平面の最大投影を使用して、「核の検索」ビルディングブロックによる単一細胞のセグメンテーションを実行しました。総核数を計算し、Alexa Fluor 488 強度に閾値を設定することで NucGreen 陽性の核を計算しました。細胞死のパーセンテージは、緑色の核の数を核の総数で割ることによって決定されました。

オレフィン底の96ウェルプレート上のウェルごとに合計50,000個のマクロファージを播種しました。細胞をMOI 1でMtbに2時間感染させた。感染後、細胞をＰＢＳで洗浄し、０．４μｇｍｌ－１ＰＩ（Ａｂｃａｍ、ａｂ１４０８３）を含む培地と交換した。イメージングは、40×1.1 NAの水浸対物レンズを備えたOPERA Phenix顕微鏡（Perkin Elmer）を使用し、隣接するフィールド間で10％のオーバーラップを備えて実行されました。 1 μm の距離にある 20 視野以上の 5 つの平面を経時的に監視し、1.5 時間ごとに 96 時間にわたってスナップショットを撮影しました。細菌の複製と細胞死を評価するために、約 1 μm の距離で個々の Z 平面の最大投影を使用する Harmony ソフトウェアを使用して分析を実行しました。細胞セグメンテーションを実行するために、「テクスチャ領域の検索」ビルディングブロックが明視野チャネルでトレーニングされ、細胞領域をセグメント化しました。細胞領域のセグメント化に続いて、「スポットの検索」および「核の検索」ビルディングブロックを使用して、Mtb および PI 陽性核をセグメント化しました。時間の経過に伴う細菌面積とPI陽性核を決定するために、スポット面積とPI陽性核の数を各時点で合計しました。倍率変化としてのMtb増殖は、次の式によって計算されました：（時点の細胞内Mtb面積の合計 - t0hでの細胞内Mtb面積の合計）/（t0hでの細胞内Mtb面積の合計）。倍率変化としての細胞死は、次の式によって計算した：（時点のPI陽性核の合計 - t0hでのPI陽性核の合計）/（t0hでのPI陽性核の合計）。

画像は Opera Phenix システムを使用して取得されました。細胞を96ウェルガラス底ビュープレートまたはオレフィン底96ウェルプレートで染色し、63×1.15 NAの水浸対物レンズで画像化しました。セグメンテーションは Harmony ソフトウェアを使用して実行されました。単一の Z 平面からの DAPI シグナルは、「Find Nuclei」ビルディングブロックを使用して検出され、次の「Find Spots」ビルディングブロックを使用して細菌セグメンテーションが実行されました。 Gal3 結合は手動で計算されました。 100 個を超えるセルを含む 5 つのフィールドが各条件で分析されました。 Mtb に対する LC3B および LC3-TVS の結合を定量化するために、63 × 1.4 NA 油浸対物レンズを備えた Leica SP8 倒立共焦点顕微鏡を使用して画像を取得しました。 Mtb と LC3-TVS の関連性の定量化は、オープンソースソフトウェア ImageJ/Fiji v1.53a を使用して手動で行われ、100 個を超える細胞を含む 5 つのフィールドが各条件で分析されました。

サンプルは、2 倍強度の固定剤 (200 mM HEPES 中の 2.5% グルタルアルデヒドおよび 8% ホルムアルデヒド、pH 7.4) を培地に添加して室温で 30 分間固定し、その後 200 mM HEPES 中の 1.25% グルタルアルデヒドおよび 4% ホルムアルデヒドで一晩置換しました。 4℃で。サンプルは、マイクロ波エネルギーと真空を使用して Biowave Pro (Pelco) で処理されました。簡単に説明すると、細胞を HEPES (Sigma-Aldrich H0887) で 2 回洗浄し、2% 四酸化オスミウム (Taab O011) と 1.5% フェリシアン化カリウム (Taab、P018) (v/v) の混合物を使用して後固定しました。サンプルを蒸留水で４回洗浄し、２％酢酸ウラニル水溶液（ＡｇａｒｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃＡＧＲ１２６０Ａ）で染色し、その後、前と同様に洗浄した。 50%、75%、90%、100%の段階的なエタノールシリーズを使用してサンプルを脱水し、プロピレンオキシドを用いて組織培養プラスチックから引き上げ、乾燥アセトンで4回洗浄し、1.5 mlの微量遠心管に移しました。サンプルには、Ultra Bed 低粘度エポキシ (EMS) 樹脂とアセトンの混合物を 50%、75%、100% の希釈系列で浸透させ、交換の合間に 600g で遠心分離しました。最後に、サンプルを 60 °C で最低 48 時間硬化させました。

超薄切片 (約 60 nm) を EM UC7 ウルトラミクロトーム (Leica Microsystems) で、振動超音波 35° ダイヤモンドナイフ (DiaTOME) を使用し、切断速度 0.6 mm s-1、自動モードで設定された周波数、および電圧6.0 V。Matataki CCD カメラを備えた 120k 1400FLASH VTEM を使用して画像を取得しました。

Mtb 感染細胞の立体学的分析: 系統的かつランダムなサンプリングにより、グループあたり少なくとも 33 個の異なる感染細胞を 3,900 倍の倍率で画像化しました。細菌の細胞内局在化に関して、細菌上の立体テストグリッドのクロスポイントをカウントし、最小倍率×16,000で撮影した画像から決定した。細胞内膜の関与の評価については、以下の基準に従って行った。(1) 単一の周囲膜、つまり細菌は、少なくとも部分的に、ファゴソーム膜を表すリン脂質二重層によってしっかりと裏打ちされていた。 (2) サイトゾル、つまり細菌はリボソームに囲まれており、ファゴソーム膜の兆候のない細胞質を表しています。 (3) 周囲の複数の膜、つまり細菌は二重または複数の膜構造で覆われています。

前述のように、細胞を MOI 1 で Mtb WT または ΔesxBA に感染させました。感染細胞をPBSで1回洗浄し、メーカーの推奨に従って、200 nM LysoTracker Green DND-26 (LTR; Invitrogen、L7526)およびNucBlue ReadyProbes Reagent (Invitrogen、R37605)を含む培地で染色した。セグメンテーションと分析は、上記のように Harmony ソフトウェアを使用して実行されました。単一の Z 平面からの DAPI シグナルは、「画像領域の検索」ビルディングブロックを使用して検出され、次に「スポットの検索」ビルディングブロックを使用して細菌セグメンテーションが実行されました。個別の関心領域はマスクに変換され、個別のしきい値が 0.8 で入力領域を含む「周囲領域の検索」ビルディングブロックを使用して拡張されました。このマスクは、各 Mtb 領域に関連付けられた LTR 平均強度を決定するために使用されました。すべての Mtb に関連する LTR の平均強度が計算され、すべての時点および条件の平均が RStudio にインポートされました。次に、結果が .csv ファイルとしてエクスポートされました。

Mtb を発現する pH/塩化物レポーター (rv2390::mWasabi、pMSP12::E2-Crimson) の分析は、Harmony ソフトウェアを使用して実行されました。セグメント化と分析は、およそ 0.5 μm の距離で個々の Z 平面の最大投影に対して実行されました。すべての Z 平面からの DAPI シグナルは、細胞セグメンテーションを正確に実行するために「核の検索」および「細胞質の検索」ビルディングブロックを使用して検出されました。 mWasabi チャネルと E2-Crimson チャネルの両方からのシグナルは、「画像領域の検索」または細菌オブジェクトを正確に定義するために手動のしきい値が適用された「スポットの検索」ビルディングブロックを使用して検出されました。 mWasabi チャンネルと E2-Crimson チャンネルからの信号は、チャンネル A + B 操作を適用することにより、「画像計算」と関数「式による」を使用してマージされました。各細菌オブジェクトについて、mWasabi および E2-Crimson の平均蛍光強度は、強度特性ビルディングブロックを計算して決定されました。各細菌オブジェクトのレポーター活性は、オブジェクトあたりの平均 mWasabi 強度とオブジェクトあたりの平均 E2-Crimson 強度の式出力を生成することによって計算されました。次に、各条件の平均値が .csv ファイルとしてエクスポートされました。

すべてのグラフは GraphPad Prism バージョン 9.4.0 (GraphPad Software LLC) で作成され、統計分析が実行されました。図は、Adobe Illustrator 2022 バージョン 26.2.1 (Adobe) を使用して編集されました。

研究デザインの詳細については、この記事にリンクされている Nature Portfolio Reporting Summary を参照してください。

ソースデータはこのペーパーに付属しています。この研究の結果を裏付けるその他すべてのデータは、合理的な要求に応じて責任著者から入手できます。

すべての分析は、公開されている R スクリプトを使用して再現可能に実行されました。

Deretic、V. 免疫におけるオートファジーと細胞内微生物に対する細胞自律的防御。イムノール。改訂 240、92–104 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gutierrez, M.、Master, S. & Singh, S. オートファジーは、感染したマクロファージにおける BCG および結核菌の生存を阻害する防御機構です。セル 119、753–766 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

中川以他オートファジーは、A 群連鎖球菌の侵入から細胞を守ります。サイエンス 306、1037–1040 (2004)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Huang, J. & Brumell, JH 細菌とオートファジーの相互作用: 生存のための戦い。ナット。 Rev.Microbiol. 12、101–114 (2014)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Upadhyay, S. & Philips, JA LC3 関連の食作用: 宿主防御と微生物反応。カー。意見。イムノール。 60、81–90 (2019)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Knodler, LA & Celli, J. 内部の見知らぬ人を食べる: ゼノファジーによる細胞内細菌の宿主制御。細胞微生物。 13、1319–1327 (2011)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jia、J.ら。ガレクチン-3 は、リソソームの修復と除去のために細胞システムを調整します。開発者セル 52、69–87 e68 (2020)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Thurston, TL、Ryzhakov, G.、Bloor, S.、von Muhlinen, N. & Randow, F. TBK1 アダプターとオートファジー受容体 NDP52 は、ユビキチンでコーティングされた細菌の増殖を制限します。ナット。イムノール。 10、1215–1221 (2009)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Fiskin, E.、Bionda, T.、Dikic, I. & Behrends, C. ネズミチフス菌感染に応答した宿主および細菌のユビキチノームの包括的分析。モル。セル 62、967–981 (2016)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

オッテン、EG et al. 細菌感染時のRNF213によるリポ多糖のユビキチン化。ネイチャー 594、111–116 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マルティネス、J. 他 LC3 関連の食作用の分子特性解析により、ルビコン、NOX2、およびオートファジータンパク質の異なる役割が明らかになりました。ナット。セルバイオル。 17、893–906 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

コスター、Ｓ．ら。結核菌は、LCP タンパク質 CpsA によって NADPH オキシダーゼおよび LC3 関連の食作用から保護されています。手順国立アカデミー。科学。 USA 114、E8711–E8720 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bussi, C. & Gutierrez, MG 時空間における宿主細胞の結核菌感染。 FEMS 微生物。改訂版 https://doi.org/10.1093/femsre/fuz006 (2019)。

TR ラーナーら。結核菌は壊死したヒトのマクロファージ内で複製します。Ｊ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ． https://doi.org/10.1083/jcb.201603040 (2017)。

シメオネ、R. 他結核菌によるファゴソームの破壊は、毒性と宿主細胞の死をもたらします。 PLoS 病巣。 8、e1002507 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ファン・デル・ウェル、N.ら。結核菌およびらい菌は、骨髄細胞のファゴリソソームからサイトゾルに移行します。セル 129、1287–1298 (2007)。

論文 PubMed Google Scholar

オーゲンシュトライヒ、J. et al. ESX-1 と結核菌のフチオセロールジミコセロサートは協調して作用し、ファゴソームの破壊と宿主細胞のアポトーシスを引き起こします。細胞。微生物。 19、1–19 (2017)。

記事 Google Scholar

TR ラーナーら。フチオセロールジミコセロサートは、リンパ内皮細胞における結核菌のサイトゾルおよび細胞内負荷へのアクセスを促進します。 BMCバイオル。 16、1 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Quigley、J.ら。細胞壁脂質 PDIM は、結核菌のファゴソーム脱出と宿主細胞からの脱出に寄与します。 mBio 8、e00148–17 (2017)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barczak、AK et al. 結核菌の細胞内感染の系統的かつ多パラメータ分析により、協調的な毒性についての洞察が得られます。 PLoS 病巣。 13、e1006363 (2017)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ロペス・ヒメネス、AT 他 ESCRT とオートファジー機構は連携して、マイコバクテリウムを含む液胞における ESX-1 依存性の損傷を修復しますが、感染の封じ込めには逆の影響を及ぼします。 PLoS 病巣。 14、e1007501 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

バーナード、EM 他ヒト iPSC 由来マクロファージの結核菌感染は、ゼノファジー回避中の複雑な膜動態を明らかにします。 J. Cell Sci. 134、jcs252973 (2020)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

フランコ、LH 他。ユビキチンリガーゼ Smurf1 は、結核菌の選択的オートファジーおよび抗結核性宿主防御において機能します。細胞宿主微生物 21、59–72 (2017)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マンザニロ、PS 他 PARKIN ユビキチンリガーゼは、細胞内病原体に対する耐性を仲介します。ネイチャー 501、512–516 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Watson、RO、Manzanillo、PS & Cox、JS 細胞外結核菌 DNA は、宿主 DNA 感知経路を活性化することにより、オートファジーの細菌を標的とします。セル 150、803–815 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimmey、JM et al. 結核菌感染時の好中球媒介免疫病理学におけるATG5の独特の役割。ネイチャー 528、565–569 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Behar、SM & Baehrecke、EH 結核: オートファジーは答えではありません。ネイチャー 528、482–483 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

チャンドラ、P. et al. 結核菌は RAB7 の動員を阻害し、マクロファージにおけるオートファジーの流れを選択的に調節します。科学。議員 5、16320 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ロマニョーリ、A. et al. ヒト樹状細胞における結核菌によるオートファジー流動の ESX-1 依存性障害。オートファジー 8、1357–1370 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カップス、I.ら。スメグマ菌の共発現系を用いた蛍光タンパク質間のエネルギー移動。ジーン 278、115–124 (2001)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Florey, O.、Gammoh, N.、Kim, SE、Jiang, X. & Overholtzer, M. V-ATPase と浸透圧の不均衡は、エンドリソソームの LC3 脂質化を活性化します。オートファジー 11、88–99 (2015)。

論文 PubMed Google Scholar

van Wilgenburg, B.、Browne, C.、Vowles, J. & Cowley, SA 部分的に定義された条件および完全に定義された条件下での、ヒト多能性幹細胞からの単球由来マクロファージの効率的で長期的な生産。 PLoS ONE 8、e71098 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ホール・ロバーツ、H. 他 TREM2 アルツハイマー病変異体 R47H は、ヒト iPSC 由来マクロファージのノックアウトと同様の転写調節異常を引き起こしますが、機能的表現型はわずかしか引き起こしません。アルツハイマー病研究所それで。 12、151（2020）。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

ハイアット、J. et al. CRISPR-Cas9 リボ核タンパク質を使用した同質初代ヒト骨髄細胞の効率的な生成。 Cell Rep. 35、109105 (2021)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Barczak、AK et al. 結核菌の細胞内感染の系統的かつ多パラメータ分析により、協調的な毒性についての洞察が得られます。 PLoS 病巣。 13、1–27 (2017)。

記事 Google Scholar

Quigley、J.ら。細胞壁脂質 PDIM は、結核菌のファゴソーム脱出と宿主細胞からの脱出に寄与します。 mBio 8、1–12 (2017)。

記事 Google Scholar

Tan, S.、Sukumar, N.、Abramovitch, RB、Parish, T. & Russell, DG 結核菌は、宿主細胞の免疫状態に対する相乗的な合図として塩化物と pH に反応します。 PLoS 病巣。 9、e1003282 (2013)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

カスティージョ、EF 他。オートファジーは、細菌の負担と炎症を抑制することで活動性結核から守ります。手順国立アカデミー。科学。 USA 109、E3168–E3176 (2012)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

JL フリン実験的結核菌感染から得た教訓。微生物が感染します。 8、1179–1188 (2006)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

マックミッキング、JD 他結核に対する防御遺伝子座としての一酸化窒素合成酵素の同定。手順国立アカデミー。科学。 USA 94、5243–5248 (1997)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schmidt-Supprian, M. & Rajewsky, K. 条件付き遺伝子ターゲティングの気まぐれな研究。ナット。イムノール。 8、665–668 (2007)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Kramnik, I.、Dietrich, WF、Demant, P. & Bloom, BR 毒性の結核菌による実験的感染に対する耐性の遺伝子制御。手順国立アカデミー。科学。 USA 97、8560–8565 (2000)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ji、DX 他結核菌に対する I 型インターフェロンによる感受性は、IL-1Ra によって媒介されます。ナット。微生物 4、2128–2135 (2019)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kreibich, S. et al. オートファジータンパク質は、サルモネラ菌 3 型分泌システムによって損傷したエンドソーム膜の修復を促進します 1. Cell Host Microbe 18, 527–537 (2015)。

論文 CAS PubMed Google Scholar

Diao、J.ら。 ATG14 は、オートファゴソームのエンドリソソームへの膜結合と融合を促進します。ネイチャー 520、563–566 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

キム、HJ 他 Beclin-1 と相互作用するオートファジータンパク質 Atg14L は、SNARE 関連タンパク質スナピンを標的にしてエンドサイトーシス輸送を調整します。 J. Cell Sci. 125、4740–4750 (2012)。

CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

マーフィー、KC 他 ORBIT: マイコバクテリア染色体の遺伝子工学の新しいパラダイム。 mBio 9、e01467-18 (2018)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Takaki, K.、Davis, JM、Winglee, K. & Ramakrishnan, L. ゼブラフィッシュにおける Mycobacterium marinum 感染症の病因と治療の評価。ナット。プロトック。 8、1114–1124 (2013)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

Asterie-Dequeker、C. et al. 結核菌のフチオセロールジミコセロサートは、細胞膜脂質の組織変化を誘導することによってマクロファージの侵入に関与します。 PLoS 病巣。 5、e1000289 (2009)。

記事 PubMed PubMed Central Google Scholar

ホジキンス、A.ら。 WGE: ゲノム工学用の CRISPR データベース。バイオインフォマティクス 31、3078–3080 (2015)。

論文 CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Skarnes, WC、Pellegrino, E. & McDonough, JA ヒト幹細胞における相同性指向修復効率の改善。方法 164–165、18–28 (2019)。

論文 PubMed Google Scholar

リファレンスをダウンロードする

研究のさまざまな面でご支援いただいたヒト胚性幹細胞ユニット、電子顕微鏡 STP および高度光学顕微鏡 STP に感謝いたします。初代細胞のヌクレオフェクションにご協力いただいた C. Bourges および J. Lee (フランシスクリック研究所) に感謝します。この研究はフランシス・クリック研究所（MGGへ）によって支援されており、同研究所は英国がん研究（FC001092）、英国医学研究評議会（FC001092）、ウェルカム・トラスト（FC001092）から中核的資金提供を受けている。このプロジェクトは、欧州連合の Horizon 2020 研究およびイノベーションプログラム (助成契約番号 772022) に基づいて欧州研究評議会 (ERC) から資金提供を受けています。オープンアクセスの目的で、著者は、この投稿から生じた著者が承認した原稿バージョンに CC BY 公共著作権ライセンスを適用しています。 CB は、マリー・スクウォドフスカとキュリーの助成金協定番号 713406 に基づいて、欧州呼吸器学会および欧州連合の 2020 年下期研究革新プログラムから資金提供を受けています。PS は非奨学金の FEBS 長期フェローシップで支援されており、欧州連合の資金提供を受けています。マリー・スクウォドフスカとキュリーの助成契約SpaTime_AnTB番号892859に基づく2020年下期研究およびイノベーションプログラム。

エリオット・M・バーナード

現在の住所: スイス、エパランジュのローザンヌ大学免疫生物学部

ピエール・サントゥッチ

現在の住所：エクスマルセイユ大学、CNRS、LISM、マルセイユ、フランス

Beren Aylan、Elliott M. Bernard、Enrica Pellegrino の著者も同様に貢献しました。

結核における宿主と病原体の相互作用研究室、フランシス・クリック研究所、ロンドン、英国

ベレン・アイラン、エリオット・M・バーナード、エンリカ・ペレグリーノ、ローレ・ボテラ、アントニー・ファーンズ、ナタリア・アタナシアディ、クラウディオ・ブッシ、ピエール・サントゥッチ、マキシミリアーノ・G・グティエレス

PubMed Google Scholar でこの著者を検索することもできます

MGG はこのプロジェクトを発案し、研究の主な監督者でした。 BA、EMB、EPは実験を実施し、データを分析しました。 LB は、この研究で使用されたすべての Mtb 株を生成し、特徴付けました。 AF は電子顕微鏡分析を実行しました。 NA、CB、PS は幹細胞培養とマクロファージ産生に寄与しました。 MGG が最初の草案を書き、BA が数値を作成しました。 BA、EMB、および EP は、すべての著者からの意見をもとに原稿を改訂しました。

マキシミリアーノ・G・グティエレスへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

Nature Microbiology は、この研究の査読に貢献してくれた Maziar Divangahi と他の匿名の査読者に感謝します。

発行者注記 Springer Nature は、発行された地図および所属機関の管轄権の主張に関して中立を保っています。

a、ATG7-/- CRISPR戦略の概略図。茶色の丸は PAM 配列の方向を示し、緑色の線は ATG7 のエクソン 2 とエクソン 3 に隣接するイントロンを標的にするために使用される sgRNA を示します。黒い矢印は、ターゲティング後の単一クローンの遺伝子型決定に使用されるプライマー (GF2 および GR2) を示しています。 b、c、100 nM BafA1、100 nM BafA1 単独または 50 μM の存在下または非存在下での飢餓後の ATG7+/+、ATG7-/- iPSC (b) および iPSDM (c) における LC3B、p62、および ATG7 の代表的なウェスタンブロットモネンシンを2時間。 d、ATG14-/- CRISPR戦略の方向性の概略図。茶色の丸は PAM 配列の方向を示し、緑色の線は ATG14 のエクソン 5 に隣接するイントロンを標的にするために使用される sgRNA を示します。黒い矢印は、ターゲティング後の単一クローンの遺伝子型決定に使用されるプライマー (GF1 および GR1) を示しています。 e、f、100 nM BafA1、100 nM BafA1単独または50 μMの存在下または非存在下での飢餓後のATG14+/+、ATG14-/- iPSC（e）およびiPSDM（f）におけるLC3B、p62およびATG14の代表的なウェスタンブロットモネンシンを2時間。 3 つの独立した生物学的複製からの代表的なウェスタンブロット (n = 3)。

ソースデータ

WT、ATG14、ATG7 KO 単球およびマクロファージのフローサイトメトリー特性評価。マーカーの名前はグラフの各列の上部に示され、細胞の遺伝子型は各行の先頭に示されます。ピンクはアイソタイプコントロールを表し、青は対応するマーカーを表します。

ソースデータ

a、左のグラフは、感染後2時間のATG7-/-またはATG7+/+ iPSDMにおけるMtb WTまたはDesxBA領域の定量分析を示しています。右のグラフは、同じ生物学的複製からの感染後 2、24、48、72、および 96 時間の感染細胞の割合を示しています。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±SEMとして示されています。 (b) 左側のグラフは、感染後 2 時間の ATG7-/- または ATG7+/+ iPSDM における Mtb WT または DcpsA 領域の定量を表します。右のグラフは、同じ生物学的複製からの感染後 2、24、48、72、および 96 時間の感染細胞の割合を示しています。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±SEMとして示されています。（ c ）Mtb WT、ΔesxBAまたはΔcpsAによる感染の2時間、24時間または48時間におけるATG7+/+およびATG7-/- iPSDMにおけるATG7、p62、およびLC3Bレベルのウェスタンブロット分析。 2 つの独立した生物学的複製からの代表的なウェスタンブロット (n = 2)。

ソースデータ

a、iPSDM を Mtb WT、DcpsA、または DcpsA:cpsA で 2 時間、24 時間、および 48 時間感染させ、間接免疫蛍光により p40 Phox について染色しました。示された時点での、各株への p40 Phox リクルートの代表的な画像。画像は 3 つの独立した生物学的複製を表しています。スケールバー: 10 μm。 b、WT Mtb、DcpsA、またはDcpsA:cpsAへのp40 Phox動員の定量分析。データは、3 つの独立した生物学的複製の平均 ± SD です。一元配置分散分析に続いて、Šídák の多重比較検定 *p < 0.033、ns = 有意ではありません。

ソースデータ

a、左のグラフは、感染後2時間のATG14-/-またはATG14+/+ iPSDMにおけるMtb WTまたはDesxBA領域の定量分析を示しています。右のグラフは、同じ生物学的複製からの感染後 2、24、48、72、および 96 時間の感染細胞の割合を示しています。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±SEMとして示されています。 (b) 左側のグラフは、感染後 2 時間の ATG14-/- または ATG14+/+ iPSDM における Mtb WT または DcpsA 領域の定量を表します。右のグラフは、同じ生物学的複製からの感染後 2、24、48、72、および 96 時間の感染細胞の割合を示しています。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±SEMとして示されています。（ c ）Mtb WT、ΔesxBAまたはΔcpsAによる感染の2時間、24時間または48時間におけるATG14+/+およびATG14-/- iPSDMにおけるATG14、p62、およびLC3Bレベルのウェスタンブロット分析。 3 つの独立した生物学的複製からの代表的なウェスタンブロット (n = 3)。

ソースデータ

a、Mtb WT、Mtb ΔesxBA、またはMtb ΔcpsAに感染したATG7+/+またはATG7-/- iPSDMにおける内因性Gal-3局在の代表的な画像。画像は、核染色 (青)、GAL3 (緑)、および Mtb E2-Crimson (赤) を示しています。スケールバー: 10 μm。 b、感染の2時間、24時間または48時間後のMtb WT、Mtb ΔesxBAまたはMtb ΔcpsAとGal-3の会合の手動定量化。 3 つの独立した実験から収集されたデータ。結果は平均値±SEMとして示されています。一元配置分散分析に続いて、Šídák の多重比較検定を行いました。***p < 0.001、**p < 0.01、*p < 0.05、ns = 有意ではありません。 c、Mtb WTおよびMtb ΔesxBAに感染したATG7+/+またはATG7-/- iPSDMの代表的な画像。LysoTrackerおよびNucBlue色素で染色し、ハイコンテンツイメージングによる感染の2時間後および24時間後にライブモードで画像化した。画像は、核染色 (青)、LysoTracker (緑)、および Mtb E2-Crimson (赤) を示しています。スケールバー: 10 μm。 d、平均蛍光強度としてのMtbとのLTR関連の定量分析。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。結果は平均値±SEMとして示されています。一元配置分散分析の後に、Šídák の多重比較検定 (ns = 有意でない) が続きます。 e、100 nM BafA1の存在下、感染48時間におけるrv2390::mWasabi、pMSP12::E2-Crimsonレポーターを発現するMtb WT、ΔesxBAまたはΔcpsA株に感染したATG14+/+またはATG14-/- iPSDMの代表画像。 f、100 nM BafA1の存在下でのATG14+/+またはATG14-/- iPSDMによる感染の示された時点でのMtb WT、ΔesxBAまたはΔcpsA株におけるrv2390プロモーター活性の定量分析は、E2に対するmWasabi MFIの倍率変化として計算されました。 -単一細菌イベント用のクリムゾンMFI。 2 つの独立した実験のうちの 1 つを表すデータ (n = 3 つの独立したウェル)。

ソースデータ

補足ビデオ 1 および表 1 ～ 4 の凡例。

WT および ATG14 KO iPSDM における Mtb 複製のライブイメージング: イメージングは、隣接するフィールド間で 10% オーバーラップする 40 × 1.1 NA 水浸対物レンズを備えた OPERA Phenix 顕微鏡を使用して実行されました。単一の視野から 1 μm の距離にある 5 つの平面の最大投影を 1.5 時間ごとに 96 時間監視しました。 Opera Phenix でのイメージングでは、明視野は λex = 透過率/λem = 650 ～ 760 nm を使用して検出され、PI (赤) は λex = 561 nm/λem = 570 ～ 630 nm を使用して検出され、E2-Crimson Mtb (緑) が検出されました。 16 ビット scMOS カメラを使用して、λex = 640 nm/λem = 650 ～ 760 nm を使用。

未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

フローサイトメトリーデータ。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

未処理のウェスタンブロット。

統計ソースデータ。

オープンアクセスこの記事はクリエイティブコモンズ表示 4.0 国際ライセンスに基づいてライセンスされており、元の著者と情報源に適切なクレジットを表示する限り、あらゆる媒体または形式での使用、共有、翻案、配布、複製が許可されます。クリエイティブコモンズライセンスへのリンクを提供し、変更が加えられたかどうかを示します。この記事内の画像またはその他のサードパーティ素材は、素材のクレジットラインに別段の記載がない限り、記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれています。素材が記事のクリエイティブコモンズライセンスに含まれておらず、意図した使用が法的規制で許可されていない場合、または許可されている使用を超えている場合は、著作権所有者から直接許可を得る必要があります。このライセンスのコピーを表示するには、http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/ にアクセスしてください。

転載と許可

Aylan、B.、Bernard、EM、Pellegrino、E. 他。 ATG7 および ATG14 は、ヒトマクロファージにおける細胞質ゾルおよびファゴソーム結核菌の複製を制限します。 Nat Microbiol 8、803–818 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

引用をダウンロード

受信日: 2022 年 1 月 24 日

受理日: 2023 年 1 月 24 日

公開日: 2023 年 3 月 23 日

発行日：2023年5月

DOI: https://doi.org/10.1038/s41564-023-01335-9

次のリンクを共有すると、誰でもこのコンテンツを読むことができます。

申し訳ございませんが、現在この記事の共有リンクは利用できません。

Springer Nature SharedIt コンテンツ共有イニシアチブによって提供

ネイチャー微生物学 (2023)